李晶晶，张文馨，张 倩，刘艳月，谷红丽，万菲菲，王 晶

1)郑州大学第一附属医院感染科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院肝胆外科 郑州 450052

肝衰竭是临床常见的危重症之一，病死率高达70%～80%[1]；目前肝衰竭的治疗包括去除病因，对症、支持治疗和维护内环境稳定(如人工肝)，干细胞或肝细胞移植，最终部分患者依赖于肝移植。“二次打击”学说认为体内免疫应答过强、内毒素血症、细胞因子紊乱等多种因素与肝衰竭发生有关；肝衰竭时大量肝细胞坏死和凋亡，肝细胞功能受损，“残存”肝细胞不能满足身体代谢的需要，引起血氨升高、乳酸中毒、血糖紊乱、吲哚水平增高等一系列代谢紊乱；而继发血氨升高可以再次诱导肝细胞损伤[2-5]。氨在体内聚集，还可透过血脑屏障干扰脑能量代谢，从而引起肝性脑病[6-7]。因此如何调整体内代谢途径(如降低血氨)是目前肝衰竭治疗研究的热点[8]。门冬氨酸鸟氨酸(ornithine aspartate，OA)为常用降血氨药物[9]。奥拉米特是一种乳清酸盐，可改善清蛋白、白蛋白及血清总蛋白的水平[10]。血氨代谢通路主要有氨甲酰磷酸合成酶(carbamoyl phosphate synthetase,CPS) Ⅰ途径和CPS Ⅱ途径，CPS Ⅰ是血氨代谢通路中尿素循环的限速酶，CPSⅡ是CPS Ⅰ的同工酶，其主要参与嘧啶合成。人体内氨代谢通过CPS Ⅰ途径即鸟氨酸循环将有毒的氨合成尿素由肾脏排出体外。肝衰竭后，CPS Ⅰ途径受抑制，导致体内血氨蓄积，从而引发CPSⅡ途径，合成大量嘧啶，使体内氨浓度进一步增高，加重肝衰竭[11]。本研究中，我们观察了经OA降血氨及奥拉米特补充乳清酸治疗后，急性肝衰竭大鼠血氨、血乳酸浓度、肝功能指标、肝脏病理组织学变化，及肝组织中CPS Ⅰ、Ⅱ蛋白表达情况，探讨OA联合奥拉米特治疗肝衰竭的效果及可能机制，为肝衰竭的治疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器设备清洁级雄性SD大鼠40只，体重(200±20) g，由河南省实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(豫)2011-0001。OA购自武汉启瑞药业有限公司，奥拉米特购自湖南中南制药有限责任公司，脂多糖、D-氨基半乳糖购自Sigma-Aldrich(中国)。乳酸测定试剂盒购自上海罗氏制药有限公司，肝功能生化检测试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗股份有限公司。羊抗兔CPSⅠ、Ⅱ，鼠抗羊二抗购自美国Abcam公司，HE染色试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。迈瑞BS-820型全自动生化分析仪，BS124S型电子分析天平。

1.2 实验分组40只雄性SD大鼠中，随机选取32只腹腔注射D-氨基半乳糖700 mg/kg联合脂多糖3 μg/kg以建立急性肝衰竭大鼠模型[12]；余8只大鼠腹腔注射生理盐水5 mL/kg，为正常对照组。造模的32只大鼠，分4组处理，每组8只，分别于造模前24、16、8 h，以及造模后8、16 h灌胃给予生理盐水5 mL/kg(模型对照组)、OA 1.0 g/kg(OA组)、奥拉米特36 mg/kg(奥拉米特组)、OA+奥拉米特(联合干预组)。剔除造模过程中死亡大鼠。最后一次灌胃24 h后进行标本的采集及指标检测。

1.3 血氨、乳酸浓度及肝功能指标的检测戊巴比妥麻醉大鼠，心脏采血，检测血氨、乳酸、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、血清白蛋白(ALB)浓度。

1.4 大鼠肝组织病理学观察及CPSⅠ、CPSⅡ蛋白表达的检测取肝右叶下部组织，用中性福尔马林固定，石蜡包埋，3～5 μm厚切片，HE染色，光学显微镜下观察大鼠肝脏组织学形态。将制备好的大鼠肝组织切片脱蜡脱水后，柠檬酸钠抗原修复3 min，PBS冲洗后加入体积分数3%H2O2处理10 min，加入山羊血清于湿盒中封闭10 min；加入羊抗兔CPSⅠ和CPSⅡ抗体(1∶1 000稀释)4 ℃过夜孵育；次日PBS冲洗后加入二抗室温孵育10 min，PBS冲洗，DAB染色，苏木精复染，晾干后封片，光学显微镜下观察。CPSⅠ、CPSⅡ阳性细胞的表现为胞质呈黄褐色颗粒。每只任选5个视野(×400)分别计数CPSⅠ、CPSⅡ阳性细胞，取均值。

1.5 统计学处理实验数据采用SPSS 17.0进行分析。正常对照组和模型对照组各指标的比较采用两独立样本t检验；模型对照组、OA组、奥拉米特组及联合干预组各指标的分析采用2×2析因设计的方差分析；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 急性肝衰竭大鼠模型的构建与正常对照组相比，模型对照组大鼠肝功能指标均增高，提示急性肝衰竭大鼠模型造模成功。模型对照组大鼠血氨和乳酸浓度均高于正常对照组，提示急性肝衰竭大鼠体内代谢异常。模型对照组大鼠肝组织中CPS Ⅰ蛋白表达水平低于正常对照组，CPS Ⅱ蛋白表达水平高于正常对照组，提示急性肝衰竭大鼠尿素合成途径受抑制。见表1。

表1 正常对照组和模型对照组各指标的比较

2.2 肝组织病理表现正常对照组大鼠肝脏组织肝小叶结构完整、清晰，肝索呈放射状排列，无肝细胞变性坏死现象(图1A)；模型对照组大鼠可见弥漫性肝细胞坏死，肝窦出血，肝小叶结构紊乱，炎症细胞浸润(图1B)；奥拉米特组与模型对照组比较未见明显差别(图1D)；OA组(图1C)及联合干预组(图1E)相较于模型对照组，肝脏病变相对较轻，坏死面积较小，可见残存的肝小叶结构。

A～E:分别为正常对照组、模型对照组、OA组、奥拉米特组、联合干预组

2.3 模型对照组与各干预组大鼠血氨、乳酸浓度的比较见表2。OA组及联合干预组血氨和乳酸浓度均较模型对照组降低，联合干预组降低最为显著，表明OA可以改善模型大鼠的代谢，奥拉米特可以协调增效OA的改善作用。

表2 4组血氨、乳酸浓度的比较

2.4 模型对照组与各干预组大鼠肝功能指标的比较见表3。OA和奥拉米特均可改善模型大鼠肝功能，两者联合，协同增效。

表3 4组肝功能指标的比较

2.5 模型对照组与各干预组大鼠肝组织中CPS Ⅰ、CPS Ⅱ表达的比较见图2、表4。与模型对照组比较，OA组和联合干预组大鼠肝组织中CPS Ⅰ表达升高，OA组、奥拉米特组和联合干预组CPS Ⅱ表达降低，联合干预组变化更显著。

A～E:分别为正常对照组、模型对照组、OA组、奥拉米特组、联合干预组CPS Ⅰ的表达；F～J:分别为正常对照组、模型对照组、OA组、奥拉米特组、联合干预组CPS Ⅱ的表达

表4 4组大鼠肝组织中CPSⅠ、CPS Ⅱ表达的比较

3 讨论

肝衰竭是一个多因素诱发的，多机制推动的级联病理过程，诱发因素以炎症反应、内毒素血症和缺血缺氧最为常见，继而引起体内血氨升高，高血氨严重影响急性肝衰竭的预后[6,12-13]。有研究[14]表明，肝衰竭患者血液中含有多种毒素，其中多数来源于肠道细菌的分解产物，包括硫化氢、氨等，这些有毒物质不能被及时代谢，再次被吸收入血，则加重肝细胞的损伤。氨在血液中主要以NH4+离子形式存在，通过NH4+受体进入细胞，最后在线粒体内通过尿素循环以尿素形式排出体外。血氨代谢通路主要有CPS Ⅰ及CPS Ⅱ途径。CPS Ⅰ是尿素循环的限速酶，N-乙酰谷氨酸是其正调节物，N-乙酰谷氨酸缺乏时CPS Ⅰ几乎没有活性。CPS Ⅱ在细胞质中，与嘧啶核苷酸的合成有关，不受N-乙酰谷氨酸调控。正常人体内血氨代谢以CPS Ⅰ途径为主，即主要通过鸟氨酸循环合成尿素由肾脏排出体外[15]。如何调整体内免疫应答，减少内毒素吸收或者改善肝脏缺血缺氧，通过尿素循环降低体内血氨等都是目前肝衰竭治疗研究的热点[16]。

本研究结果显示，模型对照组大鼠肝脏酶学指标(ALT、AST)及胆红素水平(TB、DB)均较正常对照组升高，血氨和乳酸浓度升高，肝组织中CPS Ⅰ蛋白表达水平降低，CPS Ⅱ蛋白表达水平升高。因此推测急性肝衰竭大鼠体内尿素合成途径受抑制，血氨代谢异常，导致氨在体内蓄积，从而引起一系列肝脏损伤。

OA为常用降血氨药物，可促进ATP生成[6]。奥拉米特作为一种乳清酸盐，为嘌呤及嘧啶衍生物前体，可促进核酸代谢平衡，并在体内合成核酸，纠正蛋白质、脂质、葡萄糖的代谢异常，同时有效防止肝细胞坏死和肝纤维化，刺激肝细胞再生，活化肝细胞，改善清蛋白、白蛋白及血清总蛋白的水平[17]。本研究结果显示，OA可以降低急性肝衰竭模型大鼠血氨和乳酸浓度，改善模型大鼠的代谢功能、肝功能和肝脏病理表现，升高肝组织中CPS Ⅰ的表达，降低CPS Ⅱ表达；奥拉米特单独作用虽仅可改善模型大鼠的肝功能，但奥拉米特可以协同OA进一步改善模型大鼠的代谢功能、肝功能和肝脏病理表现，升高肝组织中CPS Ⅰ的表达和降低CPS Ⅱ表达。本研究结果提示OA及奥拉米特联用，可以通过平衡体内代谢、降低血氨浓度，减轻血氨对肝脏的损伤。

由于实验条件所限，本实验存在一些不足之处：①本实验构建的大鼠模型血氨浓度在200 μmol/L左右，而临床实际中肝衰竭患者血氨水平可能远远高于这个水平，所以本研究结论还需要临床上的进一步验证。②检测的指标为常规生化指标，未从细胞因子、mRNA等水平切入进行深入研究，在机制探讨方面仍有很大的不足。

综上所述，降血氨药物OA及保肝药物奥拉米特联合应用有可能成为重症肝病治疗的有效方法。进一步探讨两者的肝脏保护以及血氨代谢通路调节的作用机制，将对肝衰竭尤其是肝性脑病的治疗提供科学依据及新的思路，具有重要的指导意义。