王嫣 王海滨 徐东平 许友山 夏卫

丙型病毒性肝炎不仅是威胁人类健康的传染病，而且也影响临床的输血安全。全球约有1.8亿人口感染丙型肝炎病毒（HCV），且全世界范围内每年新感染HCV的患者高达10万人[1-2]。HCV主要通过血液传播，国外30%～90%输血后肝炎为丙型肝炎，我国输血后肝炎中有33%为丙型肝炎[1]。 HCV核酸检测不仅能显著缩短HCV筛查的窗口期，而且是临床评价病毒复制水平及监测治疗效果的重要参考依据[3]。然而，HCV是一种高度变异的正链RNA黄病毒，离体后易受外界环境的影响引起RNA降解。在临床或科研实践中，样本采集后经运输和保存，甚至某些样本被反复冻融后才检测分析，这些过程均可导致病毒RNA发生降解，造成“窗口期”感染的漏检，不仅威胁血液质量安全，而且影响临床医生对患者体内HCV水平的准确评估。因此研究不同浓度HCV血清及其纯化核酸在不同储存条件下的稳定性特点具有重大意义。

本文用血站HCV阴性献血者血清作为稀释液将临床收集的107IU/mL HCV血清稀释成105IU/mL、103IU/mL，探讨临床常见的高、中、低三种浓度HCV血清及其纯化核酸随时间、温度（25 ℃、4℃、-20 ℃）的变化特点。

材料与方法

1 一般资料 样本来源于2018年7月～2019年6月在解放军总医院第五医学中心（原解放军三O二医院）确诊为丙型病毒性肝炎患者58例，该院临检中心检测血清抗HCV抗体均为阳性且HCV RNA载量为107IU/mL，诊断符合2004年公布的《病毒性肝炎防治方案》的诊断标准[4]。由该院的全军传染病研究所临床研究管理中心收集血清于50 mL离心管-20 ℃冻存，忽略期间的降解，以实验稀释后的浓度为实验的初始浓度。2019年5月～6月本站收集100例经2次血清抗体检查和1次核酸筛查后正常的献血者血清作为本实验的稀释液，干冰保存运输至全军传染病研究所临床研究管理中心，并由该实验室开展3种不同浓度HCV血清及其纯化核酸随时间、温度（25 ℃、4 ℃、-20℃）变化特点的研究。

2 仪器与试剂 仪器采用上海宏石SLAN 96P荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪，Qiagen RNA病毒提取试剂盒、Qiagen RNA病毒纯化试剂盒、HCV核酸定量检测试剂盒均购自凯杰生物工程（深圳）有限公司。

3 方法

3.1 标本前处理：临床收集50 mL HCV RNA载量为107IU/mL血清作为第一份血清，血站收集的两份50 mL HCV阴性血清作为实验稀释液，从第一份血清中取0.75 mL加到50 mL阴性血清中，充分混匀后制成第二份血清，再从第二份血清取0.75 mL加入另一份50 mL阴性血清中，充分混匀制成第三份血清。等量倍比稀释后经PCR定量检测，3份HCV血清浓度分别为

1.18 ×107IU/mL、1.32×105IU/mL、1.88×103IU/mL作为本研究的3种初始浓度，将血清及其核酸经纯化试剂盒纯化后各分装成45份分别储存在25 ℃、4 ℃、-20 ℃条件下。随后于1天、3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天分别取出不同温度储存的血清与核酸检测病毒载量的变化情况，实验重复3次，计算均值及标准差。

3.2 HCV RNA病毒载量检测：采用凯杰生物工程（深圳）有限公司的HCV核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法）进行核酸提取和PCR扩增检测。核酸提取与纯化严格按照试剂盒说明书进行，同时设HCV阴性对照品、临界阳性对照品、强阳性对照品。向1.5 mL的灭菌离心管中加入25 μL蛋白酶溶液，并加入待测样本200 μL和新鲜配制的裂解液，充分混匀，于56 ℃水浴15 min。再加入250 μL无水乙醇，彻底混匀。15～25 ℃静置5 min，转入加套管的核酸纯化柱，6 000 g离心1 min。倒掉套管中的废液，将提取柱重新放入套管中。向核酸纯化柱中先后加入500 μL洗液1、洗液2、无水乙醇，分别于6 000 g离心1 min，弃液，放入新的提取柱于套管中，弃套管。将提取柱放入新的收集管中，20 000 g离心3 min，彻底去除乙醇。弃收集管，将核酸纯化柱放入干净的1.5 mL离心管中，打开提取柱的盖子，56℃水浴3 min。将核酸纯化柱放入另一干净的1.5 mL离心管中，加入60 μL洗脱液，盖上盖子，室温静置10 min。20 000 g高速离心1 min，收集滤出液，做好标记，4 ℃保存备用。提取的核酸在2 h内进行PCR扩增。PCR 扩增按照试剂盒说明书配置反应液，每个反应体系含有HCV RT-PCR反应液28 μL，酶混合物2 μL，待测样品的核酸提取物20 μL，反应总体系50 μL。扩增和检测参数为50 ℃ 30 min，95℃ 15 min，95 ℃ 15 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 15 s，荧光信号收集设在50 ℃，45个循环。扩增检测根据设置的HCV定量标准品相应浓度由仪器软件自动分析结果。

4 统计学处理 将样本处理组及各时间点的检测结果进行对数转换，并计算均数和标准差。采用SPSS17.0软件进行多个样本与多个时间相关联，采用多元球形检验，P＜0.05，差异有统计学意义。

结 果

1 血清H C V载量与储存温度及初始浓度的关系 血清H C V载量随储存时间的延长呈显著变化（F=3 7 5.4 4 9，P＜0.0 5），差异有统计学意义，HCV载量随储存时间的延长呈现下降趋势。血清HCV载量随时间的变化与储存温度、初始浓度均相关（F=1.941，P＜0.05），差异有统计学意义。107IU/mL、105IU/mL、103IU/mL血清分别储存在不同条件下1天、3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天后分别取出，在室温条件下提取核酸和检测其病毒核酸载量，进行不同浓度的血清样本在相同储存时间不同温度下比较发现，107IU/mL、105IU/mL、1 03IU/mL三者间两两比较均存在显著性差异（P＜0.05），HCV浓度越高其稳定性越好。4 ℃与-20℃储存的血清HCV载量无显著性差异（边缘P值，P＝0.68＞0.05），两者均与25 ℃储存的血清HCV载量存在显著性差异（P＜0.05）。如图1所示，实验表明4 ℃与-20 ℃储存比25℃更好的保持HCV RNA的稳定性。 如图1显示，在25℃储存条件下，103IU/mL、105IU/mL、107IU/mL HCV血清样本分别存放9天、12天、35天后其载量趋于零，表明25 ℃储存血清易造成HCV核酸的降解。

图1 三种初始浓度HCV血清病毒载量在不同温度下随时间的变化

2 HCV纯化核酸与储存温度关系 103IU/mL、105IU/mL、107IU/mL HCV纯化核酸在25 ℃、4 ℃与-20℃存放70天，其结果如图2所示，其浓度变化与初始浓度呈负相关（P＜0.05）。由图2可见，随着时间的延长，浓度越低的纯化核酸会逐渐降解趋于零，103IU/mL的HCV纯化核酸在25 ℃存放49天后降解趋于零，在4 ℃与-20 ℃存放56天后呈现显著降解。而高浓度的107IU/mL HCV纯化核酸随时间的延长降解变化不明显。

图2 三种浓度HCV纯化核酸在不同温度存储下随时间的变化

讨 论

核酸扩增技术由于灵敏性强、特异性高，能迅速再现血清或血浆病毒载量，已被广泛应用于病原体载量的临床检测。由于HCV是一种RNA病毒，离体后易受外界环境的影响引起RNA降解，因此，标本采集后的保存条件对HCV检出率有直接影响。

血清样本病毒浓度与储存温度直接影响HCV的稳定性。BALERIOLA[5]、DAMEN[6]等研究证实，HCV RNA储存在-70 ℃12个月甚至15个月仍然稳定。刘长利等[7]报道，血样在4℃保存7～14天，其HCV RNA的检出量变化不明显。SENER[8]等研究表明，不同水平HCV RNA的血样在4 ℃保存35天后，HCV RNA的检出量变化不明显，其稳定性与标本中HCV RNA含量呈正相关。我们通过研究临床常见的107IU/mL、105IU/mL、103IU/mL HCV血清载量在不同储存条件下随时间变化的特点，发现103IU/mL、105IU/mL、107IU/mL HCV血清样本分别在25℃存放9天、12天、35天后，其载量呈明显的下降趋势，且随时间的延长，下降趋势愈见明显。曾有文献[9]报道，血液中HCV RNA起始浓度较低，其稳定性越差，短时间常温保存便会造成病毒核酸的降解，此结论与我们实验的结果相符。与25 ℃储存相比，4 ℃和-20 ℃能较好的保持HCV血清样本的稳定。然而，4 ℃和-20 ℃储存相比较，差异不显著，为边缘P值，我们今后将扩大样本量、延长实验周期进一步研究。

HCV纯化核酸浓度对其稳定性有直接影响，随着时间的延长，储存温度的影响更加显著。有文献[10]报道，HCV核酸在室温（25 ℃）和4 ℃中储存至少3天以上依然稳定。JOSE´等[9]人的研究表明，HCV和HIV RNA储存在-20℃中超过5年的核酸载量没有明显变化。近年有文献[11]报道纯化的HCV RNA及HIV RNA在2～8 ℃条件下至少可以保存7天。本实验中HCV纯化核酸在25 ℃、4 ℃与-20 ℃条件下储存70天其浓度变化与初始浓度呈负相关。

由于RNA结构的特殊性，研究HCV血清及其纯化核酸的稳定性和影响因素对血液筛查具有深远的意义。临床检测HCV载量可提示病毒复制能力，对了解疾病的自然进程起着至关重要的作用。献血者中潜在的HCV感染者，大部分是“窗口期”低病毒载量且易漏检的感染者，严重威胁血液制品的安全。优化血液标本运输条件和储存方法，对获得准确的病毒载量、防止“窗口期”漏检、保障血液制品安全具有重要意义。通过上述的研究结果表明，4 ℃与-20 ℃保存HCV血清，能更好地保持样本的完整性。我们在实际工作中，应保证样本在4 ℃或-20 ℃运送与保存，如未能及时检测，需尽早提取并纯化核酸，保证其检测结果符合病毒的真实载量，有效鉴别“窗口期”的潜在感染者。

致谢我们由衷地感谢解放军总医院第五医学中心临检中心及全军传染病研究所临床研究管理中心的技术支持与实验指导！

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突