林俊填 麦志周 杨富燕 伍伟健 刘运芝 余玉婷

艾地苯醌是一种辅酶Q10的类似物，能激活线粒体电子链系统，促进ATP的生成，改善脑缺血、缺氧时的能量代谢，而且还具有抗氧化作用，可消除脑缺血、缺氧时产生的大量自由基，从而阻止自由基对线粒体膜的脂质过氧化，保护线粒体膜维持其正常的生理机能[1-3]。因此，其主要用于治疗慢性脑血管病及脑外伤等所引起的脑功能损害。另外，艾地苯醌还具有抗动脉粥样硬化的作用[4]，是脑能量代谢的一种改善剂[5]。血小板胞浆内有丰富的线粒体，其主要功能是进行生物氧化，产生ATP供血小板活动所需。虽然临床上进行血小板输注越来越常见，但血小板体外保存时间短一直是临床输血领域公认的难题。本文主要研究艾地苯醌对血小板生物学特性的影响，探讨其在血小板保存方面是否有潜在的应用价值。

材料与方法

1 实验仪器 血小板聚集仪（北京STEELEX公司）、流式细胞仪（美国BD公司）、全自动血液分析仪（日本SYSMEX公司）、血小板保存箱（美国Helmer公司）、高速冷冻离心机（日本HITACHI公司）、Milli-Q 超纯水装置（美国Millipore公司）、-80 ℃低温冰箱（日本三洋公司）。

2 主要试剂与药品 血小板粘附管（江苏金坛试剂站）、ADP（美国sigma公司），GSH（批号：20200916，南京建成生物工程研究所）、MDA试剂盒（批号：20201018，南京建成生物工程研究所）和JC-1检测试剂盒（批号：20200824，南京建成生物工程研究所）；CD62p-FITC（批号：348936，美国BD公司）；CD61-PE（批号：346035，美国BD公司）、小鼠IgG1-FITC（批号：719522，美国BD公司）、小鼠IgG1-PE（批号：742633，美国BD公司）。

3 标本来源 本站单采的富血小板血浆标本6例。

4 方法

4.1 贫/富血小板血浆的制备：取本站单采血小板6例标本进行实验。为避免单采血小板可能残留的红细胞（RBC）的干扰，我们先将单采血小板混匀后置于50 mL一次性无菌离心管中，以1 000 r/min离心10 min，小心取上清置于新离心管中，此上清液即为富血小板血浆（platelet rich plasma, PRP）。将上述富血小板血浆吸于中号培养皿中，置于血小板培养箱中恒温振荡保存。剩余的血浆继续以3 000 r/min离心15 min后用相同的方法取出上清液，即可得贫血小板血浆（platelet poor plasma, PPP），备用。用自动血液计数仪检测PRP中含有的血小板数目，检测三次取平均值，用血细胞保养液ACD-A（亦可用pH 7.4 PBS缓冲液）调整血小板计数浓度为200×109/L。为方便后述实验，我们根据实验需要分别取3 mL PRP置于干净培养皿中，并加入终浓度为10 μg/mL艾地苯醌浓缩液（DMSO配制）作为实验组，另一培养皿中取3 mL PRP加入艾地苯醌浓缩液等量的空白DMSO作为实验对照组[6]。将上述培养皿置于血小板专用保存箱中恒温振荡保存6 h。

4.2 血小板粘附率的检测：采用血小板粘附管（玻珠柱）法进行测定，将粘附管与注射针进行连接，并从培养皿中直接吸取PRP，当PRP接触玻璃珠时，开始计时，掌握好血液通过玻珠柱的速度，使血浆通过四等分的玻珠时，每段时间为5 s，共计20 s。分别采集玻珠柱前后端的PRP，进行手工法血小板计数，计算血小板粘附率，每例标本重复3次，取平均值。

4.3 血小板聚集率的检测：PPP管采用与PRP管相同稀释方法进行稀释，以稀释后PPP管作为血小板聚集实验的空白对照。应用四通道血小板聚集仪检测血小板的聚集率，在检测前打开仪器预热至37 ℃，比色皿内加入转子、稀释后的PRP或PPP溶液，将比色皿放到血小板聚集仪通道中预热5 min后进行测量，分别加入1.0 mmol/L的ADP，检测血小板的最大聚集率，每例标本重复3次，取平均值。

4.4 艾地苯醌处理前后MDA、GSH的对比：分别吸取相应剂量的PRP，严格按相关试剂的说明书进行操作与检测（比色法），每例标本设3个平行管，取平均值。

4.5 流式细胞仪的检测

4.5.1 血小板膜表面CD62p的变化：按照文献[7]分析血小板CD62p的检测方法进行血小板阳性率的测定。在对照管和试验管中各加入血小板悬液5 μL，再分别加入10 μL小鼠免疫球蛋白IgGl-FITC抗体、10 μL小鼠IgGl-PE抗体、10 μL CD62p-FITC抗体和10 μL CD61-PE抗体，使血液标本与各种试剂轻轻混匀后，放在实验室阴暗处、避光保存15～20 min左右。加入磷酸盐缓冲液0.5 mL,准备上机检测。使用光源488 nm的氩激光，流式细胞术获取并分析3×104个血小板，通过前向角散射光FSC、侧向角散射光SSC和CD61-PE染色的对数图设门识别血小板群，然后分析门内血小板CD62p的阳性率。每例标本重复测定3次，取平均值。

4.5.2 膜电位JC-1的检测：严格按试剂盒说明进行操作，取 200 μL JC-1工作液，加入5 μL浓缩血小板，混匀后置于暗室中孵育30 min，加入1%多聚甲醛800 μL，于4 ℃避光继续孵育30 min，混匀后上流式细胞仪进行检测。取5 μL浓缩血小板加入50 μL PBS作为空白对照。同样捕获3×104个血小板作参数分析，以阳性百分比（%）表示结果。每例标本重复测定3次，取平均值。

5 统计学处理 本研究应用 Graphpad Prism 7.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，两组组别间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 血小板粘附试验 结果显示，与对照组相比，经10 μg/mL艾地苯醌作用6 h后的实验组，血小板粘附率有一定的下降，详见表1。

2 血小板聚集试验（ADP诱导法） 经10 μg/mL艾地苯醌作用6 h后的实验组，与对照组相比，血小板聚集能力亦有一定程度的下降，详见表格1。

3 MDA和GSH检测结果 结果显示，经10 μg/mL艾地苯醌作用6 h后，实验组的MDA和GSH水平与对照组之间均有显著性的差异，详见表1。

4 流式细胞检测结果 结果显示10 μg/mL艾地苯醌作用后，血小板膜上的CD62p表达与对照组间无显著性统计学差异；而实验组JC-1较对照组有一定程度的增加，且两者间有显著性统计学意义，详见表1，图1。

图1 流式细胞仪检查血小板CD62p和JC-1指标变化

表1 艾地苯醌作用前后血小板相关指标的变化表

讨 论

红细胞采集后使用不同的保养液保存，可使体外保存时间得到明显延长，如ACD保存液体可保存红细胞21天，而使用MAP和SAGM红细胞添加液可使红细胞保存时间延长至35天，使用AS-1或AS-3可延长至42天[8]。反观血小板的体外保存情况，多种因素都可能引起离体血小板失去活性。采用血小板专用保存袋，使用正确的保存温度与振荡条件，单采血小板在体外室温下也最多可保存5天。因此，如何延长血小板的体外室温保存时间也一直是困扰临床输血领域的难题。

CD62p又称GMP140、P-选择素，是选择素超家庭的成员之一，是一种血小板膜蛋白，选择性分布于静止血小板或巨核细胞内的α颗粒中，血小板活化时，α颗粒迅速与血小板膜整合并释放CD62p，使之出现于血小板表面，因此，CD62p的表达是血小板活化的一个特征指标[9]。

线粒体膜电位是指线粒体内膜两侧离子浓度不同所产生的跨膜电位差，是ATP合成和释放的动力，是评价线粒体功能的敏感指标[10]。JC-1是一种碳氰化合物类阳离子荧光染料，可跨膜进入活细胞内定位于线粒体膜上，其聚集程度随线粒体膜电位升高而增加。单体在激发光为527 nm时，呈绿色荧光；聚集体在激发光为590 nm时，呈红色荧光。JC-1特异性地与线粒体内膜结合，只在线粒体膜电位崩解时才释放出来[11]。

脂质氧化终产物丙二醛MDA在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性，它的产生还能加剧膜的损伤，因而测试MDA的量可反映机体脂质过氧化的程度，间接反应出细胞损伤的程度。谷胱甘肽GSH作为体内一种重要的抗氧化剂，能够清除人体内的自由基[12]；由于GSH本身易受某些物质氧化，所以它在体内能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被有害物质氧化，从而保证蛋白质和酶等分子生理功能的正常发挥[13]。因此，测定体液或细胞内GSH和MDA水平是常用的反映氧化应激水平的重要指标。

文献报道[6]艾地苯醌可以明显的保护骨髓间质干细胞，促进细胞增殖并减少细胞凋亡。受此启发，本研究主要是通过艾地苯醌减少血小板胞内的氧化应激从而达到延长血小板寿命的目的。研究结果显示，应用10 μg/mL艾地苯醌作用后，实验组较对照组GSH水平有一定的增加，而MDA水平有一定程度的下降，此结果说明细胞胞内的抗氧化水平提高。另外，结果还显示胞内的JC-1水平提高，说明血小板的线粒体活性得到增强。以上结果说明艾地苯醌应该对血小板的寿命有一定保护作用。结果还显示，艾地苯醌实验组与对照组相比，血小板的粘附率和最大聚集率均有一定程度的下降，说明艾地苯醌可能会影响到血小板的粘附与聚集功能。流式细胞检测CD62p结果显示实验组较对照组无显著性差异，则说明血小板没有脱颗粒与活化，这几个结果说明艾地苯醌可能对血小板的粘附、聚集和脱颗粒功能产生抑制作用。有文献报道[14]艾地苯醌可以抑制血小板聚集，其机制是可能影响TXB2的生成，与本文的结果基本一致。以上结果亦可间接说明，目前艾地苯醌主要用于缺血性脑损伤的治疗，一方面有利于帮助脑部神经细胞功能的恢复，另一方面则对防止脑血栓的形成有一定帮助。

综上所述，本研究结果提示10 μg/mL艾地苯醌可影响血小板内的线粒体功能，改善血小板内的氧化应激状态，从而有利于血小板的保存。但是，本研究结果也初步证实艾地苯醌对血小板的粘附、聚集和颗粒释放等生物学功能有一定的影响，这对于血小板保存和临床应用方面又是一种不利的影响。因此，艾地苯醌在血小板的保存中能否应用，还需要进一步的实验研究与探讨。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突