心肌异常肥大导致的心室重构是慢性充血性心力衰竭(CHF)发生、发展主要的病理生理机制[1]。恶性室性心律失常导致的心源性猝死是CHF患者的主要死亡原因[2]。后除极是恶性室性心律失常的主要促发机制，L型钙离子通道电流(ICa-L)的增强是诱发后除极，尤其是早期后除极的始动因素[3-4]。血管紧张素Ⅱ受体1型(AT1R)-钙调磷酸酶(CaN)信号通路在心肌细胞肥大及伴随的离子通道重构的调控中有重要作用[5-7]。但该信号通路对肥大心室肌细胞ICa-L的调控作用尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

苯肾上腺素(PE)、胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培养基和胰蛋白酶购自Gibco公司。5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brdu)、氯沙坦(Los)、环孢素A(CsA)、苯肾上腺素(PE)和Ⅱ型胶原酶购自Sigma公司。兔源钙CaN A亚基β亚单位(CaNAβ)抗体购自德国Merck Millipore公司，鼠源GAPDH抗体购自上海康成生物公司。BCA蛋白质定量试剂盒购自北京中杉金桥公司。其他试剂均为国产分析纯以上级别。Bio-Rad 550酶标仪、Bio-Rad化学发光仪购自Bio-Rad公司。PCR仪购自加拿大MJ Research公司。电极拉制仪(PP830型)购自日本Narishige公司。膜片钳放大器(Axopatch700B)及附件购自美国Axon公司。

1.2 实验动物

1 d龄SD大鼠乳鼠，雌雄不限，清洁级别，由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供，许可证号SCXK(京)2016-0006。

1.3 乳鼠心室肌细胞分离培养及分组

分离乳鼠心室，剪碎，消化(胰蛋白酶终浓度0.1%、Ⅱ型胶原酶终浓度0.03%)细胞。采用差速贴壁分离技术，得到纯化的心室肌细胞[7]。于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

心室肌细胞培养24 h，更换含5%FBS的DMEM培养基，据干预方式不同分为4组：对照组细胞不予干预；PE组细胞常规培养1 h后予终浓度为0.1 mmol/L的PE干预24 h；……