米晓云，盛肖刚，吴建勇，汪萍，杨学云，魏玉荣*

（1新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐，830013）

（2新疆动物疫病研究重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830013）

（3新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆 乌鲁木齐830011）

犬流感（canine Influenza，CI）是一种由犬流感病毒（Canine Influenza Virus，CIV）引起的急性接触性呼吸道传染病。犬是流感病毒生态循环中的重要中间宿主，马流感病毒（H3N8亚型）、禽流感病毒（H3N2亚型、H5N1亚型、H5N2亚型和H10N8亚型）和人流感病毒（H1N1亚型）等均可感染犬[1-6]。犬H3N2亚型流感毒株2006年由中国分离并报道，其基因序列与韩国水鸟的禽源H3N2基因序列高度同源[7-8]。随后研究报道，犬H3N2亚型流感在中国、韩国、泰国及美国等地流行[9-12]。尽管目前尚未有CIV跨种感染人的报道，但犬的流感病毒中间宿主作用和“病毒混合容器”角色，注定无法忽视它在流感病毒生态循环中的重要作用，及其对人类公共卫生安全造成潜在的威胁。为了解乌鲁木齐地区流浪犬和宠物犬群体中流感现状，评估其对公共卫生危害性，本研究对部分流浪犬和宠物犬进行了犬流感病毒血清学和病原学调查。

1 材料与方法

1.1 被检样本

流浪犬基地流浪犬血清样本和鼻拭子样本各100份采集于2019年1月；宠物店就诊宠物犬血清样本150份和鼻拭子样本79份收集于2019年1月至2019年9月。鼻拭子样本放置于含500 μL PBS缓冲液（pH 7.2）的2 mL离心管中。所有被检样本-20℃保存备用，统一检测。

1.2 主要试剂

DL 2000 DNA Marker和TakaRa PrimeScriptTM One Stemp RT-PCR Kit Ver.2购自购自 TakaRa；ID Sreen®influenza A Antibody Comptition Multi-species试剂盒购自ID VET；TIANamp Virus RNA Kit购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物

根据NY/T-772-2013合成流感检测通用引物M229[13]，根据文献合成扩增 CIV 检测引物 cH3N2-602F和cH3N2-1145R[14]。参照GenBank序列（登录号：MK212413、MK212411）设计HA和NA基因引物，见表1。引物由新疆昆泰锐生物技术有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 CIV血清学检测

-20℃保存的鼻拭子样本56℃灭活处理30 min后加入直径3 mm钢珠3粒，将离心管置于Tissuelyser-LT破碎仪中进行震荡5次，50 Hz，30 s/次。震荡结束后离心管至4℃离心机中8000 rmp离心5 min，取离心管中上清液提取病毒RNA，保存于－80℃备用。CIV RNA提取操作按TIANamp Virus RNA Kit说明书于生物安全柜中进行。

1.5 CIV基因扩增

以提取的病毒RNA为模板，先扩增M基因，检测是否流感病原学阳性。具体按TakaRa Prime-ScriptTM One Stemp RT-PCR Kit Ver.2说明书操作，在0.2 ml PCR管中加反应体系共50 μL：2×Onestep RT-PCR buffer 25 μL，酶混合液4 μL，M-229 U/M-229 L（20 pmol/μL）4 μL，无RNA水14 μL，RNA模板3 μL；其中阴性对照模板为3 μL无RNA水。反应参数为：42℃ 30 min；94℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30 cycles，72 ℃保温10 min。PCR扩增结束后，取产物10 μL琼脂糖凝胶电泳鉴定。有特异性条带的扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序为CIV M基因的样本，按上述方法，用引物cH3N2-602F/cH3N2-1145R扩增，反应参数为：42 ℃ 30 min；94 ℃ 5min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72℃ 35 s，30 cycles，72℃保温10 min。PCR扩增结束后，取产物10 μL琼脂糖凝胶电泳鉴定。有特异性条带的样品，分别再用引物cH3N2-HA-l/cH3N2-HA-1701R和cH3N2-NA-l/cH3N2-NA-1403R扩增流感HA基因和NA基因，反应参数为：42℃30 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30 cycles，72 ℃保温10 min。PCR扩增结束后，产物10 μL经琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增产物再次送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.6 序列比较分析

测序序列经NCBI中BLASTn比对确认，用Lasergenev7.1 DNAStar软件进行序列整理、校对和拼接，利用MEGA5.0软件绘制系统进化树。

2 结果

2.1 犬流感血清学结果

采集的100份流浪犬血清样本和150份宠物犬血清样本进行ELISA检测，结果显示，流浪犬CIV抗体阳性率58%（58/100），宠物犬CIV抗体阳性率5.33%（8/150），见表2。

表2 犬血清流感抗体ELISA方法检测结果

2.2 CIV病原学结果

2.2.1 CIV基因扩增结果

M基因扩增与测序鉴定，以CIV鼻拭子样本RNA为模板，One-step RT-PCR方法扩增目的基因，电泳结果显示100份流浪犬中有4份样本的PCR产物可见约229 bp条带，宠物犬79份样本中有1份PCR产物大小与预期大小相符，见图1。有特异性条带的PCR产物纯化后送基因公司测序，经BLASTn比对，所测序列均为CIV基因。

图1 鼻拭子样本M基因扩增结果

H3N2亚型CIV的初步鉴定，将测序鉴定为CIV的RNA样本，再次用引物cH3N2-602F/cH3N2-1145R扩增，均可见预期540 bp的特异性条带，见图2。

图2 鼻拭子样本H3N2亚型初步鉴定结果

HA和NA基因扩增与测序鉴定，经引物cH3N2-602F/cH3N2-1145初步鉴定为H3N2亚型的2份流浪犬RNA样本和1份宠物犬RNA样本再次扩增HA和NA基因，电泳结果显示3份样本均有1701 bp和1403 bp的预期大小特异性条带，见图3和图4。

图3 鼻拭子样本HA基因扩增结果

图4 鼻拭子样本NA基因扩增结果

2.2.2 HA和NA基因测序分析

测序序列经BLASTn比对确认，用Lasergenev 7.1 DNAStar软件进行序列整理、校对和拼接，拼接的核苷酸序列再次进行BLASTn比对，可见拼接序列与犬流感H3N2亚型同源性最高，将其分别命名为A/canine/Xinjiang/1/2019(H3N2)、A/canine/Xinjiang/2/2019(H3N2)和 A/canine/Xinjiang/3/2019(H3N2)。

2.2.3 HA基因遗传进化分析

运用MEGA5.0软件构建基于HA基因的H3N2 CIV遗传进化树，见图5。从遗传关系可见，2016年后的H3N2 CIV形成一个独立的分支，本研究测序的3株CIV也处于此分支。分析病毒分子特征，这一分支的HA蛋白的第226位是Q（谷氨酰胺）、第228位是G（甘氨酸）、146位是S（丝氨酸）、第242位是I（异亮氨酸）。而2006年至2015年期间的CIV HA蛋白的第146位是G（甘氨酸）或S（丝氨酸）、第242位是V（颉氨酸）。

图5 基于HA基因的H3N2亚型流感毒株遗传进化分析

3 讨论

2012年至2017采集自北京、南京、上海和西安的犬样本CIV H3N2抗体阳性率为13.5%（54/399），其中2017年犬H3N2抗体阳性率为6.35%，而2012年至2013年期间H3N2亚型抗体阳性率为3.5%，抗体阳性率的明显升高表明目前流行的毒株可能更具传染性[15]。本研究中流浪犬CIV抗体阳性率58%（58/100），宠物犬CIV抗体阳性率5.33%（8/150）。流浪犬CIV抗体阳性率高可能与采样时间及采样群体有关。流浪犬血清样本是2019年1月集中采集于流浪犬收养基地，推测犬群中正在或曾经有CIV流行。宠物犬血清采集于宠物医院就诊犬，时间相对分散，样品相对较少，无法考察其流感抗体阳性率是否与性别、品种和年龄具相关性，病原学阳性率低可能与样本保存时间相关。本研究中病原学检测有5份样品（5/179）可扩增出CIV M基因序列，经分型引物初步鉴定为H3N2亚型，有2份流浪犬样本及1份宠物犬样本可扩增出完整的HA和NA基因序列，测序为CIV H3N2亚型。测序确认的4只CIV抗原阳性流浪犬其血清抗体也是阳性。

HA蛋白负责流感病毒与唾液酸受体的结合、入侵和膜融合，在流感病毒跨种传播中发挥重要作用。H3亚型流感病毒，当226位为L（亮氨酸）而228位是S（丝氨酸），HA蛋白结合人α-2,6受体，而当226位是Q（谷氨酰胺）而228位是G（甘氨酸），HA则偏好结合禽α-2,3受体[16]。LYU Y L等[15]认为2016年以后的H3N2 CIV是有别于以前的H3N2亚型并将其取代的新进化分支，推测起源于韩国或美国的H3N2 CIV。该分支的HA具有禽α-2,3受体结合位点，同时在第146和第242位有氨基酸突变。2006-2015年期间的CIV H3N2亚型HA蛋白第146是G（甘氨酸）和S（丝氨酸）的频率分别为91.89%和8.11%；第242位是V（颉氨酸）的频率是100%[15]。而2017年至2019年期间的CIV H3N2亚型HA蛋白第146是S（丝氨酸）和第 242位是 I（异亮氨酸）的频率均是 100%[15]。人H3N2亚型HA蛋白第146是S（丝氨酸）和G（甘氨酸）的频率分别是99.57%和0.42%；第242位是I（异亮氨酸）和V（颉氨酸）的频率分别是99.29%和0.39%[17]。由此可见HA第146S和242I的突变有利于CIV在哺乳动物中流行。本研究测序的3株CIV处于2016年后的新进化分支，发生了适应哺乳动物的HA第146S和242I突变。

宠物犬和流浪犬已逐渐成为流感病毒进化和繁衍的“温床”，在流感病毒生态循环中起到重要作用。目前虽未有强毒型CIV的报道，但是CIV亚型在持续增加。借鉴H1N1亚型猪流感pdm09病毒跨宿主感染人之前曾在猪体内数十年循环适应事件，2016年后流行于中国的进化新分支CIV H3N2的哺乳动物潜在适应性及其公共卫生安全需进一步评估。我们应积极监测以期及时阻断CIV的群体传播和适应，同时加强检疫，避免出现更多新亚型CIV。

4 结论

2019年新疆某地区犬样本CIV血清学检测流浪犬和宠物犬抗体阳性率分别为58%和5.33%；CIV病原学检测流浪犬和宠物犬抗原阳性率分别为4%和1.27%；病原学测序分析的3株CIV属H3N2亚型2016年后新进化分支，HA蛋白分析可见第146S和242I突变。HA蛋白中氨基酸哺乳动物适应突变对公共卫生安全具有潜在威胁。