郑立娟 刘健伟 秦华民 汤晨 赵旭

根尖周病是继发于牙髓感染和损伤的一种骨破坏性炎症病理损伤。细菌作为其始动因子可激发宿主产生一系列免疫应答，大量炎症细胞在被激活后产生和释放炎症介质、细胞因子和酶类等物质，导致根尖区组织破坏和牙槽骨的吸收[1]。

他汀类调脂药(Simvastatin)是3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA)抑制剂，常用于降低胆固醇水平，此外还有保护内皮、抗炎、抗氧化等多种功能[2]，近年来发现他汀类药物在调节成骨破骨平衡，抑制口腔相关炎症中也具有重要作用[3]。

核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)是在成骨细胞和骨髓间充质干细胞等表面表达的配体，其与核因子-κB受体活化因子(RANK)结合是诱导破骨细胞活化和发挥功能的必要条件，在破骨细胞的分化和成熟中起到重要作用，而RANK/RANKL的表达又受到诸多因素的调节[4]。本研究将其用在大鼠实验性根尖周炎中，观察用药后白介素-6(interleukin-6，IL-6)和RANKL在实验性根尖周炎发展中的变化，以及辛伐他汀对成骨细胞的影响，探讨辛伐他汀在根尖周病损中的作用，为辅助根管治疗的新方法提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8 周龄SD雄性大鼠32 只，体重(250±20) g，由大连医科大学动物实验中心提供。

1.1.2 实验细胞 人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell，HMSC，广州吉妮欧生物科技有限公司)。

1.1.3 主要试剂 DMEM高糖培养基(HyClone公司，美国)；胎牛血清(FBS)、青链霉素试剂(GIBCO公司，美国)；辛伐他汀(simvastatin，上海远慕生物)；LPS内毒素、NC薄膜(Sigma公司，美国)；胰蛋白酶、 蛋白裂解液(上海碧云天)；蛋白marker(Thermo Fisher公司，美国)；脱脂奶粉(BD公司，美国)； RANKL抗体、 GAPDH 抗体及羊抗兔IgG-HRP抗体(武汉三鹰生物有限公司)；人白介素6 ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)。

1.1.4 主要仪器 二氧化碳恒温细胞培养箱、超净工作台(Thermo Scientific Biological公司,美国)；倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)；酶标仪(Perkin Elmer公司，美国)；HC-2518R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器公司)；凝胶PAGE电泳仪、SDS-PAGE转膜仪(北京六一厂)；ECL成像系统(Bio-Rad公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠牙根尖周炎用药模型建立 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，小号球钻于下颌第一磨牙远中窝处开髓，放入蘸有脂多糖内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)的棉球并压紧，动物清醒后，正常饲养。大鼠分组情况：A组(正常对照组)：16 只，开髓后每日生理盐水灌胃，分别于开髓术后1、7、14、21 d处死大鼠；B组(模型观察组)：16 只，开髓后每日辛伐他汀灌胃给药，剂量为5 mg/kg·d，分别于开髓术后1、7、14、21 d处死大鼠。所有处死的大鼠剥离下颌骨，储存于4%多聚甲醛溶液中。需要进行免疫组化的骨组织提前用EDTA溶液脱钙处理。

1.2.2 X线扫描 X线牙片机拍摄下颌骨标本，8 mA、70 kV、0.08 s条件下曝光。将X线影像导入Image-Pro Plus 6.0生物图像处理软件进行统计分析。

1.2.3 骨组织RANKL免疫组织化学染色 (1)脱蜡，将组织切片用二甲苯及乙醇脱蜡；(2)水化，缓慢水流下冲洗10 min，之后用PBS溶液洗涤；(3)抗原修复，将洗涤后的组织切片放入柠檬酸盐缓冲液中，于微波炉解冻档修复20 min，室温冷却后，PBS溶液洗涤；(4)内源性过氧化酶灭活，滴加3%过氧化氢溶液，放置10 min，之后用PBS溶液冲洗3 次，每次5 min；(5)血清封闭及孵一抗，滴加山羊血清，在室温下封闭30 min，吸干封闭液后滴加稀释的RANKL抗体(1∶150)，于4 ℃冰箱过夜孵育；(6)孵二抗，次日取出切片，室温下恢复1 h后滴加生物素化二抗，室温孵育45 min，PBS溶液洗涤；(7)标记二抗，滴加相应工作液标记二抗，室温下孵育45 min，PBS溶液洗涤；(8)显色，滴加新配制的DAB显色液，于显微镜下观察显色；(9)复染，在缓慢水流下洗涤切片，滴加苏木精染液复染，并用流水冲洗；(10)脱水，中性树脂封片。于显微镜下观察染色结果。

1.2.4 HMSC细胞培养 HMSC细胞于37 ℃，5%CO2恒温细胞培养箱中培养。培养基为DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+1%双抗。在达到指数生长期时，用含有成骨诱导剂的培养基进行成骨诱导。实验分组情况：A组：常规培养；B组：常规培养+1 μg/mL LPS(或+50 ng/mL IL-6)；C组：B组+10-7mol/L 辛伐他汀；D组：B组+10-5mol/L 辛伐他汀。

1.2.5 ELISA法测定IL-6 按实验分组对细胞进行相应处理，收集细胞上清液。向空白样品孔中加入样品稀释液100 μL，向标准样品孔加入稀释后的标准品溶液100 μL，向待测样品孔加入待测细胞上清样品100 μL，胶纸封板后箱孵育90 min。加生物素化抗体工作液，胶纸封板后孵育60 min，弃去孔内液体后甩干洗板。加酶联工作液，胶纸封板后孵育60 min，弃去孔内液体后甩干洗板。加显色液显色30 min，加终止液。使用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的A值，记录并分析处理数据。

1.2.6 Western blot法检测RANKL蛋白表达 按实验分组对细胞进行相应处理，收集蛋白并定量后进行SDS-PAGE电泳。按照浓缩胶80 V恒压，分离胶120 V恒压的条件进行电泳，待蛋白指示剂到达胶底时停止电泳。取出聚丙烯酰胺凝胶，按照蛋白质Marker的指示切下所需部分，按照凝胶的大小裁切NC膜，并在两侧加放数层滤纸，从负极到正极的顺序为滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，转膜条件为250 mA恒流1 h。完成转膜后，对NC膜进行裁切并将其放入新鲜配制的5%的脱脂奶粉中封闭2 h。滴加稀释后的一抗溶液(RANKL，1∶500)，4 ℃冰箱过夜孵育。次日取出，于摇床上洗去多余一抗，擦干后孵育二抗(1∶3 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜。将发光液A、B以1∶1比例混合均匀后放入显影仪显影，并对样本条带结果记录分析。

1.3 统计方法

2 结 果

2.1 实验性根尖周炎牙槽骨吸收病灶X线影像分析

X线片示：术后7 d，对照组和辛伐他汀干预组大鼠出现根尖病灶，牙槽骨和牙骨质有轻微的破坏，但对照组与辛伐他汀干预组无明显差异; 此后，病灶的面积逐渐增大，21 d 时病灶的面积达到最大值。术后14 d起，辛伐他汀干预组的病灶区域面积开始小于对照组(P<0.05)，术后21 d辛伐他汀干预组的病灶区域面积明显小于对照组(P<0.001)(图 1)。

2.2 RANKL免疫组化染色

普通光学显微镜观察根尖组织病理切片。免疫组化阳性结果呈棕黄色，对照组和用药组的RANKL表达在术后1 d时少量出现，7 d时开始增加。对照组在14 d时继续增加，在21 d左右达峰值; 而辛伐他汀用药组的RANKL表达从14 d开始少于对照组，21 d时对照组的RANKL表达量明显高于辛伐他汀用药组(图 2)。

图 1 实验性根尖周炎牙槽骨吸收病灶X线扫描影像分析

图 2 RANKL在各组大鼠根尖病灶中的表达

2.3 细胞培养上清液中IL-6的测定

按细胞培养分组收集药物刺激后的上清培养液,根据ELISA试剂盒说明建立标准曲线。分组检测各组IL-6水平，实验结果显示，与正常培养组相比，LPS感染组中IL-6的表达明显增高(P<0.001)，而在此基础上辛伐他汀会抑制细胞IL-6的表达(P<0.001)，且辛伐他汀的剂量越高，抑制效果越明显(图 3)。

2.4 细胞RANKL蛋白表达情况

Western blot结果显示，与正常培养组相比，IL-6刺激组中RANKL的表达明显增高(P<0.001)，辛伐他汀会抑制细胞的RANKL蛋白的表达(P<0.001)，且辛伐他汀的剂量越高，抑制效果越明显。与对照组相比，LPS感染组中RANKL的表达明显增高(P<0.001)，而在此基础上辛伐他汀会降低细胞的RANKL蛋白的表达(P<0.001)，同时辛伐他汀的剂量越高，抑制效果越明显。表明辛伐他汀可抑制IL-6所导致的RANKL的激活，进而抑制炎症反应(图 4)。

图 3 LPS及辛伐他汀对HMSCs IL-6表达的影响

3 讨 论

成骨细胞和骨髓间充质干细胞表达RANKL，RANKL的胞外受体结合结构域能够与破骨细胞前体细胞表达的RANK相结合，激活RANK信号通路[5]。RANK接收到的信号将经由TRAF-6等一系列信号分子传导至核因子-κB，进而信号入细胞核，增加c-Fos的表达，启动破骨细胞生成基因的转录，最终产生成熟的破骨细胞[4]。所以RANK/RANKL信号通路是维持成骨破骨平衡的重要信号通路。该通路受到激素、细胞因子和生长因子等多种物质的调节[6-8]，故研究其在炎症过程中的变化具有重要意义。

本研究通过X线扫描发现，辛伐他汀处理根尖周炎模型大鼠可抑制炎症反应，在第14天和21天时病灶面积小于未处理组，同时免疫组化染色检测发现，大鼠根尖炎模型生理盐水组中，RANKL的表达逐渐增多，在第3周末时达到高峰，而辛伐他汀用药处理会减少大鼠根尖炎模型中RANKL的表达，在第14天和21天时最为明显。以上结果表明辛伐他汀可抑制大鼠根尖周炎的炎症进程。

图 4 辛伐他汀和IL-6对HMSC细胞RANKL蛋白表达的影响

IL-6是一种多功能的细胞因子，有广泛的生物学效应，在骨结合初期，可由成骨细胞分泌[9]。以往研究表明IL-6与牙龈炎和牙周炎的发生、发展有密切关系，是引起根尖周骨质破坏的重要炎症因子[10]。IL-6由成骨细胞激活分泌，可直接作用于成骨细胞，提高RANKL的表达[11]，抑制成骨细胞活性；或通过其他炎症因子，间接作用于破骨细胞[12]，引起破骨细胞的增殖分化，增加周围炎症，促进骨基质的降解，骨吸收发生，从而打破骨形成与骨吸收的这一动态平衡[13]。研究表明，应用人工合成的IL-6刺激骨细胞后，通路中的JAK2蛋白磷酸化程度增加，提示IL-6 可以促进骨细胞表达RANKL，并且与JAK2 的活化密切相关[11]。为了探究辛伐他汀在根尖周炎中的作用机制，实验研究了LPS刺激成骨细胞后其对IL-6的影响。ELISA检测细胞上清液发现，LPS可促进IL-6的表达，而辛伐他汀可抑制LPS引起的IL-6上调。进一步研究表明，在成骨细胞中IL-6刺激可上调RANKL蛋白的表达，同样辛伐他汀可抑制这种上调作用。以上结果表明，用内毒素处理细胞后，RANKL的表达增多，而辛伐他汀会通过抑制IL-6的表达减小这种作用，且辛伐他汀的浓度越高，对RANKL的抑制效果越明显，Western blot检测也证明了以上结论。

总之，本实验证实了适当剂量的辛伐他汀能够抑制成骨细胞中IL-6的表达，并通过RANK-RANKL信号通路影响破骨细胞的成熟和炎症进程。这些实验数据也为临床根尖周炎发病机制的研究及新的治疗方法提供了一定的理论依据。