蒋艳芳，谭 黎，向花花，文小莎，郭紫芬

(南华大学 药物药理研究所 湖南省分子靶标新药研究协同创新中心 湖南省肿瘤微环境响应药物研究重点实验室，湖南 衡阳 421001)

研究显示，在包括肺癌在内的各种肿瘤中都存在一定程度的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)过表达，EGFR已成为相关肿瘤尤其是肺癌化疗研究的重要靶标[1-2]。多数非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者中均可检测到EGFR基因突变，肺癌经确诊后的5年生存率较低[3]。因此，早发现、早诊断和早治疗是提高肺癌生存率的关键。肺癌的基因突变一直是近年来的研究热点[4-5]，现有证据表明，EGFR基因突变可能与EGFR靶向药物TKI的敏感性密切相关[6-8]。EGFR基因酪氨酸激酶区域存在的多种突变能够很好地预测TKI的治疗效果，如《科学》杂志[9]和《新英格兰医学杂志》[10]曾报道EGFR基因突变与吉非替尼疗效关系密切。本实验拟采用普通PCR及重叠PCR对肺癌EGFR基因19外显子的del18bp(Del L747-P753 ins突变)进行体外重组，即将D18MT基因片段插入pDM19-T质粒中构建突变型重组载体，以提供后续实验基础，旨在构建分子开关检测平台为肺癌早期诊断以及TKI的靶向用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠埃希菌E.coliDH5α菌株(本实验室保存)；引物(上海生工生物工程公司合成)；pMD19-T质粒(TaKaRa公司)；2×Taq PCR Master Mix，2×pfu PCR Master Mix，DNA提取试剂盒和质粒抽提试剂盒(北京天根生化科技有限公司)。本实验所用引物序列引自文献[1]。其中P1～P4用于构建EGFR基因野生型(WT)和D18MT突变重组质粒的引物，D18-S和Wide-AS用于检测EGFR基因D18MT型突变的分子开关引物。同时合成pMD19-T 载体的一对通用引物M13-47和RV-M，用于菌液PCR。……