周家旺，陆国海，李晓林*

(1.南通大学附属吴江医院，苏州市第九人民医院 骨科，江苏 苏州 215200；2.南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院(北区)骨科，江苏 苏州 215008)

骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)是近年来新发现的、BMPs家族中骨诱导能力最强的蛋白，是目前骨组织工程中研究的热点，有关BMP9成骨诱导的机制仍不完善[1-2]。Orai1最初是从免疫细胞中鉴定而来，越来越多的研究表明Orai1在其他类型细胞中也起着重要作用的观点[3-4]。新近的研究发现Orai1在骨骼代谢中具有重要作用。Orai1基因敲除小鼠出现明显的骨质疏松现象，进一步研究发现Orai1功能的抑制可导致破骨细胞和成骨细胞分化受损[5-6]。而有关Orai1在成体干细胞中的功能研究仍无研究报道。本研究拟通过体内外实验研究Orai1的功能，并探索Orai1在BMP9诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)骨向分化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级雄性BALB/c裸鼠30只，体质量15～25 g，6周龄(南京青龙山实验动物繁殖场，动物合格证号：苏20180079)。其中6只BALB/c裸鼠用于BMSCs细胞提取，24只用于体内实验。

1.1.2 实验试剂：BMP9(Santa Cruz公司)；碱性磷酸酶ELISA试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；RNA提取试剂盒，Trizol(Life Technologies公司)；转染试剂Lipofectamin2000TM(Invitrogen公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒、茜素红染色试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；Orai1单克隆抗体(Abcm公司)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(北京中衫金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的获取和培养：0.5%戊巴比妥麻醉后利用断颈法处死裸鼠后，取长短骨骨髓组织置于三抗DMEM培养基中，通过200目滤网筛去掺杂物，将悬浮细胞以1 000 r/min离心5 min，PBS吹打后移入含新鲜培养液的培养瓶中，并放入37 ℃、5%的CO2细胞培养箱中培养，细胞汇合80%时胰蛋白酶消化传代。……