刘秀洁，王新雨，宋正阳，楼国强，郝卯林，钱 巍，王万铁*

(1.温州医科大学 缺血/再灌注损伤研究所，浙江 温州 325035；2.杭州临安区人民医院 全科医疗科，浙江 杭州 311300)

肺缺血/再灌注损伤(lung ischemia-reperfusion injury，LI/RI)是一种急性肺损伤，发生于肺缺血一段时间后再灌注，其发生率随着肺溶栓、肺移植等技术的开展正逐渐增加[1-2]。Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cell type Ⅱ，AEC Ⅱ)是急性肺损伤中的重要效应细胞，其低氧/复氧(hypoxia/reoxygeneration，H/R)可以很好地模拟肺的缺血/再灌注过程[3-4]。近年来，细胞自噬(autophagy)在缺血/再灌注损伤中的作用是较为热门的研究内容，在脑、心、肝、肾等重要脏器的缺血/再灌注损伤中，细胞自噬均发挥重要作用[5-8]。本实验通过构建大鼠AEC Ⅱ的低氧/复氧模型，旨在探讨细胞自噬在LI/RI中的作用，为相关药物的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞系(上海拜力生物科技有限公司)；DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibico公司)；二甲基亚砜(DMSO)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)和雷帕霉素(上海生工生物技术有限公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学)，反转录试剂盒(Thermo Fisher scientific公司)；引物设计合成(上海捷瑞生物工程有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(中国碧云天生物技术研究所)；自噬相关蛋白p-AMPK/AMP、p-mTOR/mTOR、LC3Ⅱ、p62、Beclin-1、GAPDH抗体(Abcam公司)；二抗(中国博蕴生物科技有限公司)；其余均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 大鼠AEC Ⅱ低氧/复氧模型制备：选择处于对数增殖期的细胞，首先对细胞进行血清饥饿处理，即使用无血清的DMEM培养基。24 h后更换为无糖无血清的培养基作为低氧缓冲液，置于低氧培养箱中(参数为37 ℃，94% N2，1% O2，5% CO2)培养6 h，模拟低氧过程。再更换成无血清的DMEM培养基，常氧培养箱中(参数为37 ℃，21% O2，5% CO2)培养24 h，模拟复氧过程。……