任海伟，赵 艺，刘玉龙，冯银萍，张丙云，李金平,3※，李志忠

（1.兰州理工大学生命科学与工程学院/西部能源与环境研究中心，兰州 730050；2.甘肃省生物质能与太阳能互补供能系统重点实验室，兰州 730050；3.西北低碳城镇支撑技术协同创新中心，兰州 730050）

0 引 言

甜高粱是一种重要的 C4高糖分饲粮作物和能源作物，具有抗旱、耐涝、耐盐碱、生物量高等特点，能适应多种气候与环境条件，在中国甘肃、山东、黑龙江等地均有大面积种植，被广泛用于动物饲料、生物质能（乙醇、沼气等）和生物基材等领域[1-2]。由于甜高粱收获具有明显季节性和时效性，贮存不及时极易引起水分、糖分流失甚至腐败变质，严重影响其能源转化利用效率。青贮作为一种经典的湿法保存技术，不仅常用于作物秸秆等生物质原料的贮存[3]，而且青贮过程还蕴藏有生化预处理作用[4-5]。研究表明，青贮过程中加入乳酸菌等微生物菌剂、酶制剂、木质纤维功能分解菌等添加剂能发挥一定的强化处理作用，提高生物质的降解性能和能源产出潜力[6]。纤维素酶及产生阿魏酸酯酶的乳酸菌能促进玉米秸秆青贮发酵和木质纤维素降解，提高酶解糖化得率[7]。稻草青贮过程中添加木聚糖酶、植物乳杆菌能提高发酵质量和纤维素转化率[8]。另一方面，自然进化的鬼斧神工和农业生产智慧提示我们，“鲜活”的反刍动物瘤胃液、厌氧消化沼液等生物载体栖息有大量天然微生物菌群及其代谢酶系，是一类能有效克服木质纤维抗降解屏障的天然特异“生物处理系统”[9]。瘤胃液预处理稻草能有效促进其甲烷产量和有机质降解程度[9]。沼液预处理玉米秸秆能使其木质纤维结构变松散，降低化学反应活化能，加快纤维素分解[10-11]。更重要的是，瘤胃液、沼液这些生物载体还具备与湿法青贮过程进行耦合协同的共同环境基础（厌氧、低pH值等）、物质基础和代谢纽带。若能将富含木质纤维分解菌的沼液、瘤胃液用于甜高粱青贮过程，则有可能通过生物强化作用实现贮存和强化预处理的双重目标，以时间（贮存）争取空间（降解糖化产出），提升生物质降解潜力。

甜高粱茎秆表面覆盖有硅氧蜡质层，以及由木质素、半纤维素和纤维素形成的致密性晶体结构，使其不容易被分解。本文基于全株甜高粱的跨季贮存和能源化利用，从化学组分、发酵品质、微观结构、酶解特性等方面，比较研究瘤胃液、沼液、纤维素酶和木聚糖酶 4种添加剂对甜高粱青贮品质的动态影响，并考察不同青贮周期时的生物降解潜力差异性，进而评价 4种添加剂在青贮过程中的强化作用效果，筛选适宜的、有应用价值的青贮添加剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

全株鲜绿甜高粱取自中科院近物所武威种植基地，收获后迅速切碎至1～2 cm备用。瘤胃液取自于武威顶乐生态牧业有限公司第三养殖场，西门塔尔肉牛屠宰过程中收集瘤胃液，经4层无菌纱布过滤后迅速转移至厌氧袋，并存放至液氮罐中送回实验室，-80℃保存备用；发酵沼液来源于兰州牧工商公司荷斯坦奶牛繁育中心的沼气工程，沼液取回实验室后用高粱秸秆在（37±1）℃中温环境下富集驯化一个月；纤维素酶和木聚糖酶（酶活力为50 000 U/g）购自宁夏和氏璧生物技术有限公司。甜高粱原料的干物质、有机组分和有机酸含量如表1 所示。新鲜沼液、瘤胃液的pH值、氨氮和有机酸含量、酶活性等指标如表2所示。

表1 甜高粱的理化指标Table 1 Physicochemical indicators of sweet sorghum

表2 瘤胃液与沼液的理化指标Table 2 Physicochemical indicators of rumen fluid and biogas slurry

1.2 仪器与设备

纤维分析仪（FB800），山东海能科学仪器有限公司；液相色谱仪（Agilent 1260），安捷伦公司；X-射线衍射仪（D/max-2400），日本理学公司；扫描电镜（JSM-5600LV），日本电子光学公司；傅里叶变换红外光谱仪（Nexus670），美国Nicolet公司。

1.3 青贮发酵试验设计与取样

准确称取30份1.5 kg切碎的甜高粱进行青贮发酵试验，设置纤维素酶（CT，3 g纤维素酶溶于70 mL蒸馏水）、木聚糖酶（XT，3 g木聚糖酶溶于70 mL蒸馏水）、瘤胃液（RT，添加量为70 mL/kg）、沼液（BT，添加量为70 mL/kg）4个处理组，以及1个空白对照组（CK，添加 70 mL蒸馏水），将添加剂均匀喷洒至样品表面后迅速混匀并装入塑料桶中密封。每个试验组设3次平行，（18±2）℃恒温环境中青贮45 d和90 d，定期分析青贮质量和生物降解性。青贮样品的取样步骤以及发酵浸提液制备方法参考文献[12]进行。

1.4 青贮质量分析

1.4.1 化学成分和发酵品质

干物质（Dry Matter，DM）含量测定用105 ℃烘干恒重法，总氮（Total Nitrogen，TN）含量采用凯氏定氮法，可溶性碳水化合物（Water Soluble Carbohydrate，WSC）分析用硫酸-蒽酮法[13]，淀粉含量测定采用酸水解法，中性洗涤纤维（Neutral Detergent Fiber，NDF）、酸性洗涤纤维（Acid Detergent Fiber，ADF）和酸性洗涤木质素（Acid Detergent Lignin，ADL）含量通过纤维分析仪测定。纤维素（Cellulose，CL）、半纤维素（Hemicellulose，HC）和综纤维素（Holocellulose，HoC）组分通过公式计算[14]。pH值采用 UB-7酸度计分析，氨氮（Ammonia Nitrogen，AN）采用苯酚-次氯酸钠比色法分析，有机酸（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）等小分子发酵产物分析采用HPLC检测[7,15]。纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶活性的测试均采用南京建成生物工程研究所采购的试剂盒，具体操作参照说明步骤进行。

1.4.2 结构特性表征

利用扫描电镜观察样品的微观形貌（喷金仪喷镀40 s，镀膜厚度4 nm左右，加速电压20 kV）。利用傅里叶变换红外光谱仪分析样品官能团结构（扫描范围400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1）。采用Rigaku X-射线衍射仪分析结晶性能（Cu-Kα 为靶材，扫描速率为 1°/min，扫描范围5°～60°，加速电压 40 kV，电流 100 mA），并计算相对结晶指数[14]。

式中 CrI为相对结晶指数的百分率（%）；I002为结晶区的衍射强度（2θ=22°）；Iam为无定形区衍射强度（2θ=18°）。

1.5 生物降解性能评价

生物降解性能主要从理论生物降解潜力（Theoretical Biodegradation Potential，TBP）和实际酶解糖化得率两方面进行评价。TBP为综纤维素和木质素组分含量之比值（干物质基础）。酶解糖化能力评价方法：准确称取0.5 g甜高粱原料或青贮样品（过100目筛），以1∶20料液比加入pH值4.8、浓度为0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液，再依次添加纤维素酶（加酶量1 000 U/g）、半纤维素酶（加酶量500 U/g）、β-葡聚糖苷酶（加酶量1 U/g）进行酶解试验。恒温气浴振荡酶解72 h（150 r/min，(50±0.5 )℃)，间隔12 h测定酶解液中的还原糖浓度，并计算酶解得率（Enzymatic Hydrolysis Yield，EHY，%）[16]。

式中c为还原糖浓度，g/mL；v为上清液体积，mL；m为底物质量，g。

1.6 数据处理与统计分析

用Excel 2007软件处理基础数据，结果用平均值±标准差表示，使用Origin Pro 9.1软件绘图，SPSS 20.0软件进行双因素方差分析，单因子 ANOVO模型处理及Duncan方法对数据进行多重比较分析。

2 结果与讨论

2.1 添加剂瘤胃液和沼液的微生物菌群分析

利用Illumina HiSeq 2500 平台分析瘤胃液、沼液中的细菌菌群多样性（表3）。

表3 瘤胃液和沼液的门、属水平上细菌多样性Table 3 Bacterial diversity of rumen fluid and biogas slurry at phylum and genus level

由表3可知，瘤胃液的门水平细菌主要有厚壁菌（Firmicutes，61.00%）和拟杆菌（Bacteroidetes，31.10%），沼液中的优势细菌除厚壁菌（Firmicutes，32.58%）和拟杆菌（Bacteroidetes，35.08%）外，还含有一定量互养菌（Synergistetes，17.12%）。研究表明，大多数厚壁菌和拟杆菌的细菌菌群均有木质纤维水解和蛋白质降解能力，且二者存在一种相互促进的共生关系[17]。互养菌还能发酵产生有机酸和乙醇，也是一类重要的木质纤维分解菌[18-19]。从属水平看，瘤胃液的优势细菌属主要为克里斯滕森氏菌（Christensenellaceae，20.09%）和瘤胃球菌（22.01%）。这些细菌区系均能有效降解木质纤维素，而且前者还有发酵糖类产生乙酸、丁酸等有机酸的能力[20-21]。沼液的优势细菌主要有理研菌（Rikenellaceae，26.89%）和少量梭菌（Clostridium，5.44%）、嗜蛋白菌（Proteinip-hilum，4.00%）和假单胞菌（Pseudomonas，2.02%）。其中，假单胞菌具有攻击芳香族聚合物木质素的能力，尽管其相对丰度相对较低，但它对木质素降解仍有积极作用[10]。

2.2 添加剂对青贮过程中化学组分的影响

2.2.1 干物质含量和干物质损失率

干物质含量是评价甜高粱青贮品质优劣的重要指标。由表1和图1可知，与原料相比，青贮45 d时5个试验组的干物质含量均显著下降（P＜0.05），尤其RT组处于最低值；青贮45～90 d期间，CT、XT和BT处理组的干物质含量均随时间延长而显著降低（P＜0.05），而CK和RT组在此期间未发生明显变化（P＞0.05）。这与Naeini等[16]报道的青贮甜高粱干物质含量随时间延长而呈下降趋势结果基本吻合。分析原因，一方面，加入的纤维素酶、木聚糖酶等生物酶和沼液（富含木质纤维分解菌）在青贮发酵期间持续发生作用，将部分有机物质分解为诸如小分子有机酸、乙醇和含氮化合物等挥发性物质，使甜高粱中的干物质含量显著下降。另一方面，瘤胃液中含有大量诸如产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等木质纤维降解菌以及可以穿透植物细胞壁的真菌，多种微生物菌系协同作用使一部分纤维素和半纤维素快速分解，并转化为乙酸为主的挥发性有机酸[9]。但随着发酵时间延长，由于青贮体系pH值下降、乳酸菌等优势菌群占主导、瘤胃液中噬菌体等微生物病毒发挥抑制作用等诸多因素使得木质纤维分解菌被抑制，从而减少干物质分解，故其含量变化不显著（P＞0.05）。

再者，BT组在90 d时的干物质含量显著低于CK组（P＜0.05），但与其他处理组差异不显著（P＞0.05），这不仅是因为沼液中的微生物菌群及其酶系将淀粉、蛋白质和木质纤维素等组分降解转化；而且沼液中丰富的氨氮可作为天然氨源，使木质素内部以及木质素与多糖之间的化学键断裂，进而导致木质素膨胀并与纤维素分离，提高纤维素与半纤维素的可降解性，从而使干物质损失率增加（图1b）[10,22]。

2.2.2 可溶性碳水化合物含量

可溶性碳水化合物（Water Soluble Carbohydrates，WSC）是青贮发酵过程中乳酸菌群繁殖代谢的重要底物，含量多寡及其变化规律一定程度上也能反映不同种类添加剂在青贮过程中的强化作用效果。由图2和表1可知，青贮45 d时5个试验组的WSC含量均显著低于原料（P＜0.05），且CT和XT组的WSC含量显著低于其他试验组（P＜0.05），BT组的WSC含量最高，这可能是因为活性较强的沼液中富含木质纤维素分解菌及纤维素酶等复合酶系，相较于纤维素酶或木聚糖酶等单一酶制剂而言，更能充分有效地分解甜高粱中纤维素、半纤维素、淀粉等大分子碳水化合物，使WSC生成速率高于消耗速率，形成可溶性糖的累积效应[9]。此外，沼液还能促进秸秆木质纤维素结构的膨胀崩解，使其通透性增加，更容易被微生物及其酶系降解[22]。另一方面，青贮90 d时CT组的WSC含量较45 d时明显增加（P＜0.05），这可能是纤维素酶能降解秸秆中不与木质素存在化学键联结的细胞壁成分所致；而且青贮环境中乳酸菌占优势、腐败微生物菌群被抑制等因素也会使CT组中WSC消耗速率降低，导致WSC积累增加。

总之，整个青贮发酵期间，RT和 BT组中的 WSC含量始终高于其他试验组，尤其BT组在45和90 d时均为最高值，说明甜高粱青贮体系中添加沼液的生物强化作用效果最为明显。

2.2.3 木质纤维组分和淀粉含量

由表4可知，添加剂、时间及其交互作用均对木质纤维组分有极显著影响（P＜0.001）。中性洗涤纤维（Neutral Detergent Fiber，NDF）包括了植物细胞壁的大部分成分，主要有不溶性纤维素、半纤维素等非淀粉多糖和木质素。与原料相比，45 d时各试验组（除BT组）的NDF含量均未发生显著变化，但在 90 d时显著低于原料（P＜0.05），说明无论是否加入添加剂或何种种类，长时间青贮发酵均有助于NDF组分的降解。尤其添加沼液的BT组中NDF组分含量随时间延长呈显著下降趋势，且在整个青贮期间均显著低于其他处理组（P＜0.05）。半纤维素（Hemicellulos，HC）是组成植物细胞壁的结构性多糖，由不同类型单糖组成，常与纤维素和木质素紧密交联形成木质纤维素，该组分的含量变化也存在与纤维素相类似的趋势。因为沼液中本身存在有大量腐殖酸和可降解木质纤维素的微生物菌群，能使难降解的高聚体木质素以及被包裹的纤维素和半纤维素发生分解[23]，这些组分的降解都会使NDF含量随之下降。

酸性洗涤木质素（Acid Detergent Lignin，ADL）是影响纤维素和半纤维素等结构性碳水化合物降解的主要屏障，较高的 ADL 含量会导致生物降解性能下降，进而影响酶解糖化效率。与原料相比，5个试验组在青贮期间的 ADL含量均明显下降（P＜0.05）。尤其，RT组和BT组中的 ADL含量在 90d时分别降至 78.11 和79.01 g/kg，显著低于其他处理组（P＜0.05），这得益于瘤胃液和沼液天然具备的木质纤维分解能力，二者富含能降解植物细胞壁的微生物菌群及其酶系[23]。这与 Guo等[10]报道的玉米秸秆经沼液预处理后木质纤维素明显下降的结果一致；Candia-García等[24]也发现瘤胃液能明显降低稻草中的木质纤维组分。可见，青贮过程中加入沼液、瘤胃液能发挥明显的生物强化预处理作用，有效降低抗降解屏障组分ADL含量，促进半纤维素降解，最大限度地保存纤维素组分[11]。这与纤维组分随青贮时间延长而显著升高的变化趋势相吻合（表4）。此外，上述木质纤维组分的联动变化也间接影响能量组分综纤维素的含量多寡。青贮90 d期间，BT组中的综纤维素含量最低，RT组中的综纤维素含量最高，因为瘤胃液中的纤维分解菌对pH值敏感，在酸性青贮环境中活性较弱，降解作用趋于温和；而沼液中的纤维分解菌对pH值变化适应性较好，使综纤维素组分的含量处于最低值。

表4 青贮过程中木质纤维组分的变化Table 4 Changes of lignocellulosic components during ensiling (g·kg-1)

结合理论生物降解潜力（TBP）分析，青贮45 d时，4个添加剂组的TBP均明显增加（P＜0.05），而CK组则无明显变化（P＞0.05）。青贮90 d时，CT和XT组的TBP不增反降，而RT和BT则保持不变。说明，添加剂的加入均有助于提升青贮甜高粱的理论降解潜力，起到明显的强化处理作用，而且添加瘤胃液、沼液的作用效果相对较好，但实际改善效果需通过酶解糖化试验进行验证。

淀粉是全株甜高粱中重要的非结构性碳水化合物。由图3和表1可知，青贮45 d时，CK和CT组的淀粉含量与原料相比差异不显著（P＞0.05），而XT、RT和BT组的淀粉含量在青贮45 d时显著高于原料。然后，5个试验组的淀粉含量均随青贮时间延长而呈显著下降（P＜0.05），90 d时的5个试验组的淀粉含量均明显低于原料（P＜0.05），但组间差异不明显，说明4种添加剂对淀粉含量的影响无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 添加剂对青贮发酵品质的影响

2.3.1 pH值

青贮pH值的下降速率和程度是反映发酵品质优劣的重要指标[25]。由图4可知，发酵45 d时，由于青贮体系内乳酸菌等有益菌及其他微生物的厌氧生化反应，将可溶性糖转化为乳酸（pKa=3.86）和乙酸（pKa=4.75）等有机酸[26]，使5个试验组的pH值均迅速下降至3.67～3.90范围，明显低于原料（pH 值5.62），均达到优良青贮标准（3.8～4.2）。低 pH值能有效抑制蛋白酶活性，减少蛋白质降解，抑制对青贮有害细菌的生长，从而保障青贮品质。当青贮周期延长至90 d时，CK、CT和XT组的pH值继续显著下降（P＜0.05），维持在 3.52～4.29；RT和 BT组则呈显著增加趋势（P＜0.05），pH值分别为 4.29和 3.93。分析原因，纤维素酶、木聚糖酶对结构性碳水化合物的直接催化降解作用进一步促进了乳酸等有机酸的发酵累积，导致青贮pH显著下降[17,27]。另一方面，瘤胃液、沼液因其特有的微生态菌群结构，容易生成较高含量的乙酸[9]；而且青贮发酵生成的乳酸又会被反过来被沼液、瘤胃液中微生物菌群作为代谢底物而消耗减少[28]，导致乳酸和乙酸含量的此消彼长，这些因素的叠加造成了RT和BT组pH值随时间延长而显著升高，这与表5中的有机酸变化趋势相吻合。

2.3.2 氨氮含量

青贮蛋白质的水解通常是由植物蛋白酶将其水解为肽和游离氨基酸，然后通过微生物菌群活动进一步降解为酰胺、胺和氮等因素引起的。

由图5可知，青贮90 d期间，各试验组（除CT组不变外）的氨氮含量均随时间延长而显著下降（P＜0.05），这可能是因为较低的酸性 pH青贮环境有效抑制了芽孢杆菌、沙门氏菌等腐败菌生长以及甜高粱植株中的蛋白酶活性，从而减少蛋白质分解[29]；添加纤维素酶对限制氨氮的产生并无显著影响，这与Guo 等[30]研究结果一致。另一方面，青贮45 d时RT和BT组中氨氮含量显著高于其他试验组（P＜0.05），但仍低于优质青贮的氨氮限值（10%）。瘤胃液、沼液中自身本底含有一定量的氨氮，而且这两类添加剂也富含蛋白质降解菌，极易引发蛋白质分解和氨氮增加[9]。当青贮周期延至90 d时，RT和BT组中的氨氮含量又反而处于较低水平，这与青贮体系中较高浓度乙酸等抗菌物质有效抑制蛋白质分解菌群存在一定联系[31]。

2.3.3 有机酸及乙醇含量

小分子有机酸和醇类物质是青贮发酵过程中微生物菌群的主要代谢产物。由表5可知，随着青贮时间的延长，CK、CT和XT组中的乳酸含量显著增加（P＜0.05），这是由于外源纤维素酶、木聚糖酶的加入直接促进了纤维素、半纤维素等结构性碳水化合物的催化分解，进而通过优势乳酸菌群发酵产生并积累乳酸所致[27]。这与Zhao等[17]、陈鑫珠等[32]在柳枝稷、甘蔗梢青贮中的研究结果吻合。相反，RT和BT组中的乳酸含量随时间延长而显著下降（P＜0.05），这主要与瘤胃液微生态系统中的乳酸代谢菌能将其转化为乙酸、丙酸等物质有关。此外，优势乳酸菌群从同型发酵类型向异型发酵的转变也可能是原因之一[33]。另一方面，5个试验组的乙酸、丙酸含量均随时间延长而显著升高，且整个青贮期间 CT、XT和BT组中二者的含量均显著低于CK和RT组（P＜0.05），而在RT组中含量则相对较高。这可能是因为RT组中加入的瘤胃液存在大量产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌以及少量梭杆菌，这些微生物在厌氧条件下能产生较多的乙酸和丙酸[9]。Zhang等[34]也发现稻草厌氧发酵过程中添加瘤胃液，乙酸含量明显提高。另外，青贮90 d时RT和BT组中检测出少量丁酸，这可能是由于瘤胃液、沼液中的氨氮物质会促进梭状芽孢杆菌生长，从而产生具有损耗青贮品质的丁酸所致[9,11,17]。乙醇也是甜高粱青贮过程的重要产物，和乙酸类似均能起到一定抑菌作用，抑制腐败菌生长，有助优势乳酸菌占据主导[23]。整个青贮期间，4个添加剂组的pH值均低于4.3，乳酸/总有机酸（乳/总）值始终高于0.58，乳酸/乙酸（乳/乙）值始终大于2.0，均达到优良青贮发酵范畴[35]（除个别组），乳酸菌群发酵占主导，有效抑制了酵母菌繁殖代谢，从而显著减少了乙醇含量（P＜0.05）。其中，CT和XT组的乳/总和乳/乙比值均显著高于CK组，而RT和BT组的这两个比值在45 d时显著高于CK组，90 d时却显著低于CK组，这可能与瘤胃液、沼液中含有复杂多样的微生物菌群有关，这些微生物群落的引入打破了原本相对简单的青贮乳酸发酵型态，将乳酸作为代谢底物利用转化为乙酸、丙酸等小分子挥发酸[36]。

表5 青贮过程中有机酸与乙醇含量的变化Table 5 Changes of organic acid and ethanol contents during ensiling

2.4 甜高粱青贮前后的结构表征

2.4.1 微观形貌分析

由图6可知，未青贮的甜高粱茎秆结构较为致密，表面光滑平整，角质层形成的包埋结构无孔隙裂痕。青贮45 d时，所有试验组的甜高粱表面茎秆结构均遭受破坏。其中，CT和XT组的木质纤维结构发生微弱瓦解，RT和BT组则出现大量微孔洞、裂痕甚至断裂分层现象，形成许多凹凸不平的沟槽，并呈现条纹锯齿状，说明青贮过程中添加瘤胃液、沼液能更有效地破坏甜高粱木质纤维结构。因为瘤胃液和沼液自身富含复杂多样的古菌、真菌及原虫等微生物菌群，青贮发酵期间能穿透茎秆表面的蜡质层和木质化细胞壁，破坏茎秆内部半纤维素和木质素之间的酯键并形成裂痕[9]。

随着青贮周期的延长，90 d时五个试验组的孔洞、裂缝愈发明显，尤其添加沼液的BT组出现大面积崩解塌陷，这是因为甜高粱在青贮过程中除受到微生物菌群的持续作用外，长时间的沼液浸润也能使木质纤维结构膨胀崩解，这与Guo等[10]结果相吻合。

2.4.2 官能团分析

由图7红外光谱分析可知。

6个甜高粱样品的红外光谱图总体表现出相似特征，明显吸收峰值主要发生在3 413、2 926、1 733、1 604和1 050 cm-1。其中，3 413 cm-1处的宽峰代表纤维素羟基的伸缩振动[37]，相较于未青贮的原料（SS组）而言，5个青贮样品在3 413 cm-1处的吸收峰强度均有所减弱；青贮45 d时BT组的吸收峰强度明显低于其他处理组。说明纤维素组分在青贮期间均有不同程度地降解，其中青贮过程中添加沼液进行强化处理可在较短时间内有效降解或破坏甜高粱茎秆的结晶纤维素结构，使其发生分解作用。2 926 cm-1处的特征吸收峰表征木质素中甲基、亚甲基（C-H）的伸缩振动[37]，青贮90 d时4个处理组在此处的吸收峰均明显低于45 d，说明青贮周期的延长对木质素脱除具有积极效果，且与青贮周期呈正相关。1 733和1 050 cm-1分别代表半纤维素-木质素复合物的特征吸收峰以及半纤维素中C-O键的伸缩振动[38-39]。青贮90 d时，RT、BT和XT组在这两处的吸收峰与45 d相比明显减弱，说明青贮周期延长后瘤胃液、沼液对木质素以及半纤维素的解聚效果明显增强，青贮过程中添加木聚糖酶对半纤维素组分分解、木质素组分释放解聚有积极效果。1 604 cm-1处的伸缩振动来源于吸附水分子氢键的弯曲振动[22]。青贮后所有试验组在该处吸收峰强度均有不同程度地升高，且随青贮时间延长强度逐渐增强，说明青贮能促进纤维素无定形组分的降解。

2.4.3 X-衍射分析

如图8所示，与原料相比，五个青贮组的甜高粱样品在 2θ=22°左右均出现强吸收峰，在 2θ=9°和 2θ=17°左右出现弱峰，说明加入不同添加剂的强化作用效果和厌氧生化反应能使甜高粱茎秆中纤维素组分发生明显的结构重定向。结合相对结晶指数（CrI）可知，四个添加剂处理组的 CrI指数与 CK组和原料相比均有明显下降，其中BT组降幅最大，说明外源添加剂的加入均能有效破坏纤维素和半纤维素与木质素紧密结合的酯键与氢键；添加剂沼液中存在的高浓度氨氮更能进一步促进纤维素与木质素的剥离[40]。另一方面，90 d时XT、RT和BT组中的纤维结晶指数较45 d有所提高（表6），这可能是因为青贮时间的延长使非纤维素多糖或无定形区被溶解，导致纤维素结晶度增加[8]。此外，整个青贮期间BT组的CrI指数始终处于最低值，除了沼液中丰富的微生物菌群及其木质纤维分解酶系所带来的生物强化预处理作用外，沼液中丰富的氨氮组分对木质纤维结构的分解也可能是该处理组CrI[10]

表6 甜高粱青贮前后的相对结晶指数变化Table 6 Changes of crystallization index of sweet sorghum before and after ensiling

2.5 甜高粱青贮前后的酶解糖化效果评价

酶解糖化效果是评价木质纤维生物质降解能力优劣的重要指标[39]。如图9所示，无论甜高粱青贮与否，6个样品底物在酶解初期（＜12 h）的酶解得率均呈现快速增加、直线上升趋势，12h后酶解得率增速放缓。这是因为该阶段甜高粱中的纤维素和半纤维素组分优先被生物酶作用释放出较多的可发酵糖。随着酶解进程的推进，木质纤维底物的降解难度逐渐增加，而且还存在还原糖产物的反馈抑制作用，从而使酶解得率增速放缓[41]。另一方面，青贮甜高粱的酶解得率均显著高于原料，说明青贮发酵能通过改善甜高粱木质纤维结构、优化化学组分构成、打破碳水化合物-木质素之间联系等形式促进木质纤维组分被酶解，进而改善其酶解糖化性能。此外，不同种类添加剂的强化作用效果也不尽相同，由于瘤胃液和沼液中含有大量木质纤维分解菌及水解酶类，使BT和RT组的酶解得率明显高于CT和XT组。尤其青贮90 d时的BT组酶解糖化得率最高达84.69%，长时间的酸性青贮环境、沼液中木质纤维分解菌等微生物菌群、较高浓度的氨氮等因素都可能是有效提升酶解效能的重要原因，这些因素相互叠加起到明显的生物强化处理作用[10,22]。

3 结 论

1）纤维素酶、木聚糖酶、瘤胃液和沼液4种添加剂均能使青贮体系的pH值显著下降至4.3以下，除添加瘤胃液青贮90 d外，其他处理组的乳酸占总有机酸比例均高于0.58，乳酸与乙酸比值均高于2.0，说明四种添加剂均能有效促进乳酸发酵，改善发酵质量和青贮品质。通过强化青贮作用，还能有效促进木质纤维组分分解及其优化重组，进而提高酶解得率和生物降解性能，其中甜高粱添加沼液青贮90 d时的酶解糖化得率最高，达到了84.69%。

2）青贮甜高粱的微观结构发生了有利于生物降解性能提升的积极变化，尤其沼液、瘤胃液富含木质纤维分解菌群，能在青贮发酵的同时有效瓦解甜高粱茎秆的木质纤维抗降解屏障结构，茎秆微观表面出现明显孔洞和裂缝，使纤维素相对结晶度指数明显降低。尤其是沼液处理组的相对结晶指数在整个青贮期间均处于最低值，分别为 23.03和26.17。因此，在研究使用的4种添加剂中，添加沼液对甜高粱青贮过程的生物强化作用效果最佳。

3）综合考虑4种添加剂的资源量、易得性、成本以及对甜高粱青贮质量和生物降解性能的改善效果等因素，建议选择来源广泛、廉价易得、资源丰富的沼液作为甜高粱青贮过程的添加剂。这对于以甜高粱为原料的沼气工程运行具有重要意义，不仅能实现原料的可持续供给，提高生物降解性，还有助于消纳转化沼气工程排放的一部分沼液，减少沼液排放量。