卿海辉，张小舟，胡敏，贺茂林

随着分子生物学的发展，分子靶向治疗给骨肉瘤的治疗带来了新的希望。研究发现miRNA影响恶性肿瘤发生发展；miR-301b通过靶向头帕肿瘤综合征蛋白（Cylindromatosis，CYLD）促进三阴性乳腺癌细胞增殖；miR-301b在骨肉瘤肿瘤组织与外周血中上调表达。但miR-301b-3p其对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制尚不清楚。第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）是一个抑癌基因，参与调节细胞增殖和凋亡的多条通路，其异常表达与恶性肿瘤发生发展相关，PTEN能作为恶性肿瘤治疗中的潜在靶点。有研究报道PTEN基因启动子高甲基化导致的PTEN基因失活可能参与了骨肉瘤的发生、发展。DJ-1又名帕金森病蛋白7（PARK7），其可通过增加PTEN表达影响骨肉瘤细胞的恶性生物学行为。但miR-301b-3p是否通过PTEN影响骨肉瘤细胞的增殖、凋亡还尚未清楚。本研究在2019年3—9月开展，旨在确定miR-301b-3p对骨肉瘤细胞的影响及其机制是否与PTEN相关。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人成骨细胞（hFOB）和骨肉瘤细胞U2OS、MG63购自美国菌种保藏中心；杜尔伯格氏伊戈尔培养基（DMEM）购自美国Gibico；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒购自美国Sigma；Trizol、荧光定量试剂盒购自美国Invitrogen；双荧光素酶检测试剂盒、凋亡检测试剂盒购自北京Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组人成骨细胞hFOB和骨肉瘤细胞U2OS、MG63用DMEM培养基常规培养，取对数生长期细胞U2OS，将miRNA抑制物阴性对照（anti-miR-NC）、miR-301b-3p抑制物（anti-miR-301b-3p）转染至U2OS细胞中，记为anti-miR-NC组、anti-miR-301b-3p组；将anti-miR-301b-3p分别与小干扰RNA阴性对照（si-NC）、PTEN小干扰RNA（si-PTEN）共转染至U2OS细胞，记为anti-miR-301b-3p+si-NC组、anti-miR-301b-3p+si-PTEN组。

1.2.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-301b-3p表达水平提取hFOB细胞、骨肉瘤细胞U2OS、MG63及各组U2OS细胞的总RNA，合成cDNA后进行PCR，相对表达量用2法计算。……