刘丽艳，冯 坤，娄文勇，苏健裕，吴 虹

(华南理工大学食品科学与工程学院，轻工与食品国家级实验教学示范中心，广东 广州510640)

0 引言

食品微生物学是食品科学与工程专业的主干课程，食品微生物学实验是实践教学中的重要环节。现有实验教学通过对学生基础实验技能的培养，较好地完成了理论课知识的验证，但由于实验内容简单且欠缺关联性等因素，使得课程结束后学生理论联系实际尚不足，对科学研究的认知度仍欠缺。目前，基于“新工科”建设背景下，食品微生物实验课的教学改革仍处于起步阶段，为了提高食品微生物课程的教学水平，以工程素质人才培养为导向，结合学科发展前沿技术及与生活紧密相关的科学问题，对微生物实验课进行教学内容和实践模式的双重优化，开展综合型探索性实验具有重要意义[1-2]。

随着人类肠道菌群的发现及其对健康重要作用的逐步明确，益生菌成为微生物领域关注的热点[3]。益生菌是指对人体健康有益且与人共生的细菌或微生物。益生元是益生菌的食物，是指一些不被宿主消化吸收却能够选择性地促进体内有益菌的代谢和增殖，从而改善宿主健康的有机物质[4]。目前，常用的益生元有低聚糖类，包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖和菊粉等。此外，多糖如云芝多糖、胡萝含氮多糖，以及有些微藻类和天然植物中的蔬菜、中草药等也能作为益生元使用[5]。益生元在促进结肠菌群的生长，改善肠道微生态，促进脂质、蛋白质与矿物类代谢方面具有重要意义，愈来愈广泛地被应用于食品、饲料等领域中。

本实验以低聚果糖(FOS)、低聚异麦芽糖(IMO)作为培养基碳源，以无糖培养基和普通MRS培养基为阴性和阳性对照，考察低聚糖益生元对干酪乳杆菌(L.casei)增殖作用的影响。从实验教学案例建设、实验项目的组织及实施过程、实验结果交流展示等方面总结了探索性实验项目“益生元对益生菌的增殖效应实验”在本科实验教学中的实施过程，为食品微生物学实验教学体系更新提供教学案例，供同类课程交流、探讨。

1 益生元对干酪乳杆菌的体外生长调节作用实验

1.1实验目的

掌握灭菌、梯度稀释、微生物的接种、培养及菌落计数等操作。完成两种低聚糖对干酪乳杆菌的增殖效应检测，了解益生元对益生菌体外增殖效应评价的方法。

1.2材料及仪器

(1)菌种。干酪乳杆菌ATCC393。

(2)无糖MRS基础培养基的制备。蛋白胨，广东环凯微生物科技有限公司，10.0 g；酵母提取物，南京全隆生物技术有限公司，5.0 g；乙酸钠，西陇科学股份有限公司，5.0 g；二水合柠檬酸三铵，阿拉丁试剂(上海)有限公司，2.0 g；三水合磷酸氢二钾，广州化学试剂厂，2.0 g；七水合硫酸镁，阿拉丁试剂(上海)有限公司，0.2 g；四水合硫酸锰，合肥巴斯夫生物科技有限公司，0.05 g；吐温-80，天津市科密欧化学试剂有限公司，1 mL[6]。pH值调为6.2，灭菌条件为115 ℃，20 min。

(3)其他试剂。低聚果糖(FOS，纯度>99%)、低聚异麦芽糖(IMO，纯度>99%)购自上海伯奥生物科技有限公司。

(4)仪器及器皿。灭菌锅、厌氧培养箱、天平、移液枪及枪头、接种环、pH计、紫外分光光度计、超净工作台、具塞锥形瓶、培养皿和具塞试管等。

1.3实验步骤及内容设计

1.3.1菌株活化

取一定量受试干酪乳杆菌冷冻甘油管接种于MRS培养基中，37 ℃恒温培养24 h，涂片并革兰氏染色，经显微镜检符合干酪乳杆菌显微形态学特征后，即可以进一步实验。

1.3.2实验分组

(1)实验条件1：不同益生元对干酪乳杆菌的增殖效应。

无糖MRS培养基中分别添加2%(w/v)葡萄糖、2%(w/v)FOS、2%(w/v)IMO，以无糖MRS培养基为对照。将活化后的菌液以1%(v/v)比例接种到对应的试管中，并于接种后2、4、6、8、10、12和16 h定时取样，于600 nm波长条件下测定培养物的OD值，同时测定发酵液pH值，比较益生菌在不同培养基中的生长情况。

(2)实验条件2：不同浓度FOS对干酪乳杆菌的增值效应。

无糖MRS培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%(w/v)FOS，以无糖MRS培养基为对照。将活化后的菌液以1%(v/v)比例接种到对应的试管中，并于接种12 h后取样，于600 nm波长条件下测定培养物的OD值，同时测定发酵液pH值，比较干酪乳杆菌在不同浓度FOS中的生长情况。

以上数据均重复测定3次，取平均值。

1.3.3生长指数的计算

通过生长指数法来测定细胞生长情况，以Growth Index(GI)值为指标，比较益生菌在不同低聚糖和葡萄糖上的生长情况[7]。

式中AP16——含有样品益生元的干酪乳杆菌发酵液在培养16 h后于600 nm波长条件下的吸光度

AG16——含有样品葡萄糖的干酪乳杆菌发酵液在培养16 h后于600 nm波长条件下的吸光度

AC16——含有无糖MRS培养基的干酪乳杆菌发酵液在培养16 h后于600 nm波长条件下的吸光度

AP0——含有样品益生元的干酪乳杆菌发酵液0 h的吸光度读数

AG0——含有样品葡萄糖的干酪乳杆菌发酵液0 h的吸光度读数

AC0——含有无糖MRS培养基的干酪乳杆菌发酵液0 h的吸光度读数

1.4实验结果与讨论

1.4.1不同益生元对益生菌的增殖效应

分别以2%FOS、2%IMO作为碳源，在无糖培养基为基础培养条件下，相较于2%葡萄糖作为碳源的培养基，生长曲线直接体现出不同益生元对益生菌的增殖效应。随着干酪乳杆菌的增殖，其代谢产生的有机酸使得培养基pH值降低，因此，培养液的pH值可以反映出不同碳源对益生菌的增殖效果[8-9]。干酪乳杆菌以葡萄糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖为碳源的培养基及基础对照培养基中的生长曲线和pH值变化曲线如图1所示。

图1 干酪乳杆菌的生长曲线和pH值曲线Fig.1 Growth curves and pH curves of L.casei

由于益生菌增殖过程中短链脂肪酸的产生，培养液OD600增加的同时pH值降低，反映了益生菌在各培养液中生长的能力。由图1可知，培养2～10 h，干酪乳杆菌在Glc、FOS、IMO为碳源的培养液中的生长曲线呈现显著增长，pH值曲线同步下降。10 h之后进入生长稳定期，随后生长曲线及pH值曲线均趋于平稳。而无糖基础培养基中，干酪乳杆菌培养液的OD600水平较低，pH值变化不显著。干酪乳杆菌在以FOS、IMO为碳源发酵时表现出相似的生长活性，说明两种低聚糖对干酪乳杆菌均有益生效果。发酵16 h后，各发酵液的OD600均达到了最高水平，以FOS为碳源的培养液的OD600值为2.63，略低于Glc组的2.80，高于IMO组的2.31。此时，生长在以FOS为碳源的培养液中，干酪乳杆菌的GI为92.93，大于以IMO为碳源的培养液中干酪乳杆菌的GI，且以FOS为碳源的培养液的pH值高于Glc组，低于IMO组。生长指数较高的低聚糖碳源被认为对益生菌的益生元效果更好，因此2%FOS对干酪乳杆菌的益生效应优于2%IMO。

1.4.2不同浓度FOS对干酪乳杆菌的增值效应

无糖MRS培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%(w/v)FOS作为碳源，干酪乳杆菌经12 h发酵后培养液的OD600和pH值如图2所示。

由图2可知，当FOS浓度<2%时，随着FOS浓度的增加，培养液发酵12 h的OD600逐渐增大，pH值逐渐降低；FOS浓度达到2%时，OD600达最大值2.69，pH值为4.02；继续增加FOS浓度到4%，培养液发酵12 h的OD600及pH值均无明显变化。因此，FOS作为碳源促进干酪乳杆菌的增殖效果较好浓度为2%。

2 实验项目的组织与实施

本实验内容属于研究性实验项目，在教学方法上支持学生研究性学习、主动探索和实践、分析并解决问题，其目的是让学生独立思考、自主学习，启发学生的科研思维并培养其综合能力。研究性教学的指导思想就是把科研的过程转化为本科教学的实践，目的是为本科教学体系打下科学研究的基础[10]。本实验的实施过程分为3个阶段。

注：小写字母表示实验结果的显著性差异(P<0.05)图2 干酪乳杆菌以不同浓度FOS为碳源发酵12 h的生长曲线和pH值曲线Fig.2 Growth curve and pH curve of L.casei fermented for 12 hours with different concentrations of FOS

2.1课前开展分组讨论并确定实验方案

以24人教学班为例，学生2人一组，共分为12组，按实验条件设置2个项目任务，每6组同学对应相同实验任务开展实验。在实施的过程中，学生在教师的指导下，围绕具体的项目任务，以团队的形式分工合作来开展实验项目。教师在开课前两周布置项目任务及主要内容，强调注意事项。要求每位学生参与查阅文献资料，先在小组内开展分析、讨论，结合所查文献和已掌握的实验操作技能初步设计实验方案。

教师在开课前一周统一组织课堂讨论，按照实验的可行性、准确性等要求对各组实验方案进行审查，指出实验方案的优缺点。学生利用接下来的一周时间修订实验方案，教师课前再次检查并确定实验最终方案[11]。

2.2在课堂实施过程带入研究理念

本项目采取研究性的项目教学法，学生同时兼任实验项目的管理者和执行者，学生由被动学习变为主动学习，教师由课堂教学的讲授者、主导者变为引导者。各小组按照经确定的实验方案开展实验，在实验过程中，随堂巡视的教师不少于3位，每位教师负责8位左右学生，小组成员分工合作，合理安排任务，实验过程中遇到的困难，先在小组内讨论解决办法，再寻求随堂教师帮助。教师对学生实验的各个环节进行跟踪点评，提醒学生关注每个实验单元的实验原理和规范实验操作手法，引导学生观察益生菌生长指标的变化规律，比较添加的益生元种类及添加量对益生菌生长曲线及pH值曲线的影响，提示学生注意不同检测指标之间的联系，分析实验过程中数据的变化规律和蕴含的生物学机理，以此方式将科学研究的理念带入课堂，把研究性的项目教学法在本科实验课堂上落实并拓展[12]。

2.3综合分析实验结果并以研究论文的形式呈现

实验完成后，学生对实验结果进行比较与讨论，分析实验结果是否达到课程要求的研究目标，总结整个实验过程，找出实验成败的关键环节及实验操作关键点，实验报告以可正式发表的研究论文形式呈现，以此训练学生的科技论文写作能力。教师对学生的操作技能、结果分析能力、论文写作能力等方面进行综合评定[13]。以自愿或推荐的方式选出4组进行总结交流，这4组同学分别制作PPT向全体学生和教师展示实验过程、数据分析和结果的推理论断，报告会上鼓励交流、随时提问，以此积累口头表达和学术交流经验[14]。

3 结束语

探索性实验项目在本科教学中引发了学生对学科研究的兴趣，每个实验环节相对独立，但数据间又有联系，前一环节的实验数据与后续的实验数据互相印证，这种数据对比性较强的实验项目，使得学生对实验数据精确性的重视程度增强，从而提高了实验结果的准确性。

课程教学采取科学研究的方法，教师为学生搭建交流探讨的平台，营造互帮互助的教学氛围，从提出问题到解决问题的全过程模拟科研过程，把传统的“以课程为中心”的实验教学切换为“以问题为中心”，学生通过探索性实验将实验操作单元与理论知识融会贯通，知识把握更加系统，更重要的是培养学生利用科研思维进行自主研究的能力及团队合作精神，使其顺利开启职业生涯并尽快适应社会。