李 敏，白耘榧，黎秋玲，李 志，周智友，李汉广

（江西农业大学 生物科学与工程学院/江西农业大学应用微生物研究所/江西省菌物资源保护与利用重点实验室，江西 南昌 330045）

【研究意义】生物质能源不仅具有来源广泛，可再生的优点，还能减少温室气体排放，有助于生态平衡的维持和人类生活环境的改善[1]。在众多生物质能源中，生物柴油因具备与化石柴油高度相似的能源密度和燃烧性，且其可再生性的优点而备受人们关注。微藻相对于传统生物柴油原料（大豆、油菜、茶籽），具有油脂含量丰富、形态结构简单、生长周期短等优势，被视为生物柴油的第三代原料[2－3]。微藻的油脂产量是限制微藻生物柴油工业进程的主要因素[4-5]，因此提高微藻油脂产量是微藻生物质能源领域的研究热点之一。【前人研究进展】李双双[6]、张婷[7]和潘孝妍等[6-8]通过单因素试验和正交试验的方法分别优化培养基中的碳、氮、磷、镁、钙等因素浓度将微藻油脂产量提高了30%～41%。微藻培养基组分的优化是一个复杂的过程，传统优化方法的局限性使优化效果无法达到最大化[9－10]。响应面法采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，分析回归方程来寻求最优的工艺参数，是一种考虑因素间相互作用并能得到试验水平外优选值的数学统计方法[11]。Yang 等[12]利用响应面法优化Scenedesmussp.培养基的碳、氮、磷源等，从而获得超出实验水平之外的优选值，使其油脂产量提高了54.64%。【本研究切入点】Desmodesmus intermediusZ8是本实验室分离的一株兼性且具有较强产油脂能力的藻种[13]。由于大多数微藻属于光合自养生物，国内外对微藻培养条件的优化工作主要集中在自养培养条件上[14]。同时，采用的方法比较单一且各方法的局限性导致优化效率并不高。【拟解决的关键问题】因此，本文以所在实验室自主筛选的藻株Z8为试验对象，通过单因素试验、Plackett-Burman 因素筛选试验和响应面法对藻株Z8的异养培养基组分进行递进式优化，以期获得较高油脂产量的最佳培养工艺，为微藻生物柴油产业化发展提供可参考的实践经验。

1 材料与方法

1.1 藻种

藻种：本试验所用的藻种为链带藻Z8（Desmodesmus intermediusZ8），由本课题组从学校附近水域分离获得[13]。

1.2 试验方法

1.2.1 培养方式 异养培养[15]：以10%的接种量将对数生长期末期的藻液接种至BG-11 异养培养基中（用葡萄糖替换Na2CO3，使其作为唯一碳源），于120 r/min、温度（27±1）℃条件下避光培养6 d。

1.2.2 单因素试验设计 以藻株Z8作为试验对象，以改良的异养BG-11培养基异养培养藻株Z8，研究不同葡萄糖浓度（0，5，10，15，20，25，30 g/L）、硫酸镁浓度（0，25，50，75，150，300，450，600 mg/L）、硝酸钠浓度（0，0.1，0.2，0.3，0.5，1.5，2.5，3 g/L）、氯化钙浓度（0，0.01，0.02，0.04，0.08，0.12，0.25，0.5 g/L）、磷酸氢二钾浓度（0，0.01，0.02，0.04，0.08，0.12，0.25，0.5 g/L）、柠檬酸浓度（0，1，2，4，6，8，10，12 mg/L）对藻株Z8生长及总脂量的影响，处理组的其它因素与异养BG-11培养基一致的条件下，以藻株Z8的生物量和总脂量为参考指标，确定响应面试验的中心水平[16]。

1.2.3 响应面实验设计 Plackett-Burman（P-B）因素筛选试验[17]：根据单因素试验确定的各个因素的水平，运用Design expert 8.0 设计12 次的P-B 试验，对硝酸钠、硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾、葡萄糖、柠檬酸、EDTA 等7 个因素进行总脂量的显著性考察，每个因素设2 个水平，以单因素最优值为中心点上下取值，即高水平（+1）和低水平（-1）。

1.2.4 分析方法 生物量的测定[18]：取10.0 mL 稳定期藻液，将其通过0.22 μm 的滤膜进行真空抽滤，将抽滤所得藻泥用蒸馏水洗涤2～3次，然后将干净藻泥置于烘箱中于60～80 ℃条件下烘干至恒质量。以抽滤过培养基的滤膜为对照，按以下公式计算生物量。

式（1）中：B为微藻生物量（g/L），M为烘干后藻泥质量（g），m为滤膜质量（g）。

总脂量的测定[19]：取冷冻干燥的藻粉1.0 g 置于离心管，加入8.0 mL 4 mol/L 的HCl，振荡均匀，静置35 min，沸水浴12 min 后冷却至室温，然后加入16 mL 氯仿-甲醇（V/V=1∶1）提取剂，充分振荡，浸提20 min。于4 000 r/min条件下离心20 min，取氯仿层，加入8.0 mL含量为1.5 mg/L NaCl溶液，4 000 r/min离心20 min，取氯仿层于已称量的100 mL 锥形瓶中，将锥形瓶放置于烘箱中于60～80 ℃条件下烘至恒质量，两次质量差即为1.0 g藻粉的油脂质量，总脂量的计算公式如下：

式（2）中：P为总脂量（g/L），L为油脂质量（g），B为生物量（g/L）。

2 结果与分析

2.1 单因素影响分析

为获得响应面优化中因素设计的有效阈值，本论文首先对影响藻株Z8的生物量和总脂量中的葡萄糖、硝酸钠、硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾及柠檬酸进行单因素试验，其结果如图1所示。

图1 不同浓度因素处理下的生物量和总脂量Fig.1 Biomass and total lipids under different concentration factors

从图1 可知，随着葡萄糖添加浓度的增加，生物量与总脂量的趋势均先上升后不变；随着硫酸镁、硝酸钠、磷酸氢二钾及柠檬酸的浓度提高，生物量与油脂产量均出现先上升后下降的趋势；然而，伴随着氯化钙添加浓度的增加，生物量与总脂量的趋势没有显著变化。最终从上图可知最优的葡萄糖、硝酸钠、硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾及柠檬酸的质量浓度分别为：15，1.5，75，0.04，0.12 g/L和4 mg/L。

2.2 响应面试验分析及参数优化

2.2.1 Plackett-Burman（P-B）试验 P-B 试验是一种两水平优化试验的方法，其可在较少的试验次数内对众多因素的主效应进行精确估计［20］，试验各因素及编码水平见表1。藻株Z8培养条件优化的P-B试验设计和结果见表2。采用Design-expert 8.0软件对实验结果进行方差分析，可以得到油脂产量的一阶模型：

表1 P-B试验设计各因素及编码水平Tab.1 Level of factors in P-B test design

表2 Plackett-Burman试验设计与结果Tab.2 Plackett-Burman design and results

由表3 可知，该试验模型显著（P＜0.05），且试验各因素中硫酸镁、磷酸氢二钾、葡萄糖和柠檬酸为显著影响的因素。

表3 Plackett-Burman试验模型及方差分析Tab.3 lackett-Burman model and variance analysis

2.2.2 响应面优化 根据P-B因素筛选结果，依据中心组合试验原理通过Design expert 8.0软件进行响应面中心旋转组合试验设计及分析，寻找最优化组合，以总脂量为响应值，进行4因素5水平的响应面优化，因素及编码水平如表4所示，设计编码与响应值结果如表5所示，回归模型及系数的显著性检验见表6。

表4 试验因素水平及编码Tab.4 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in central composite design（CCD）

表5 中心旋转组合试验设计与响应值Tab.5 Design and response value of central rotation combined test

利用Design-expert 8.0 软件对结果进行多元回归拟合后，经过分析可以得到硫酸镁（X1）、磷酸氢二钾（X2）、葡萄糖（X3）、柠檬酸（X4）等4个因素对油脂含量的多元回归模型：

从表6中可知，模型的F值为5.11，P＜0.05，显示具备显著效应（表示为*），决定系数R2=0.826 6，校正系数RAdj2=0.664 8，说明实际总脂量与模型的回归值具有良好的一致性，同时该模型能解释66.48%的响应值的变化。另外失拟项的F=3.44，P=0.926＞0.05，说明失拟项不显著，所以该方程能较好地反映实际情况。因此，该模型可用于微藻油脂产量的分析和预测。从回归模型来看，X3对总脂量影响极显著，X2、X4以及交互项X3X4对总脂量影响显著，其余项不显著。说明试验因素不是简单地线性关系；4 个因素对总脂量的影响程度大小分别为：葡萄糖、磷酸氢二钾、柠檬酸和硫酸镁。

表6 中心旋转组合试验设计方差分析Tab.6 Analysis of variance in the design of central rotation combined experiment

最终通过Design expert 8.0 软件分析，得出藻株Z8异养培养的最佳工艺条件为：葡萄糖18 g/L、柠檬酸9 mg/L、磷酸氢二钾0.07 g/L、硫酸镁200 mg/L，在此条件下总脂量最大理论值为3.17 g/L，未优化培养基的总脂量1.39 g/L，相比之下优化后提高了128%。

采取上述优化条件进行3 次重复试验，结果测得藻株Z8的总脂量为3.17 g/L，与预测值基本一致（估读后数值一样），说明该回归方程与实际情况拟合较好，该模型可以较好地模拟和预测油脂产量。

3 讨论与结论

单因素试验只考虑单一因素的影响，采用这种试验方法必须首先假定各因素间没有交互作用，如果各因素间存在交互作用，利用这种方法一般会得出错误的结论[21]。正交试验虽然弥补了单因素的不足，但是无法对试验水平之外的最优值进行预测，所得的最优结果仍不够精确[22]。由于响应面法能在整个区域上找到因素和响应值之间的函数表达式，是一种能研究几种因素间交互作用并对区域外的响应值进行预测的回归分析方法[23]，可以克服传统经验方法的局限性[24]。发酵培养基各组分往往具有一定的相互作用，不同碳氮比[25]、氮磷比[26]、金属离子[27]及有机酸比例[28-29]都会对发酵过程及结果产生不同程度的影响。为提高藻株Z8的油脂产量，本论文首先通过单因素试验获得藻株Z8油脂生产的最佳工艺条件：葡萄糖15 g/L、硫酸镁75 mg/L、硝酸钠1.5 g/L、氯化钙0.04 g/L、磷酸氢二钾0.12 g/L、柠檬酸4 mg/L。然后，通过软件Design-expert 8.0 依据单因素试验结果，设计P-B 试验和中心组合试验。通过P-B 试验的结果，可以看出硫酸镁、磷酸氢二钾、葡萄糖、柠檬酸对藻株Z8总脂量具有显著影响且呈现正向作用。因此，分别选择这4个因素的高水平作为中心组合试验设计的中心点，再进行进一步的优化。最终得出藻株Z8油脂生产的最佳工艺条件：硫酸镁200 mg/L、磷酸氢二钾0.07 g/L、葡萄糖18 g/L、柠檬酸9 mg/L，其它条件与单因素优化结果一致。藻株Z8在此条件下，总脂量达到3.17 g/L，与未优化前培养条件相比提高了128%。

本论文不仅可丰富产油微藻的藻种资源，而且从本论文结果可知响应面优化策略是一种简单易行的提高藻株Z8生物量及油脂含量的方式，本研究结果可为它通过递进式优化策略提高微生物发酵性能提供可供参考的实践经验。