孙福新

柠檬酸是一类三元羧酸，3-羟基- 3-羧基戊二酸，即枸橼酸。作为生物体代谢的主要产物之一，柠檬酸大多存在于生物体果实中，目前逐渐被应用于医药、食品及化工领域。柠檬酸全球消耗量正以每年7%的增长率增长，已跃居世界发酵产品产量的第二位。伴随现代化生物技术的不断发展与成熟，采用发酵法生产柠檬酸的技术及工艺条件已不断成熟，并逐渐体现出简单便捷、生产效率高等优势，因此文章主要对柠檬酸的发酵工艺技术及其应用做了系统化的研究。

柠檬酸的发酵过程

柠檬酸的发酵生产用到了多种类型的微生物，如曲霉类、酵母类、细菌类等，其中酵母类生产柠檬酸可利用不同类型的碳源微生物，尤其是利用解脂亚罗酵母生产柠檬酸已得到广泛的应用。然而，由于柠檬酸是一类能量代谢产物，因此需满足代谢不平衡条件。其中，黑曲霉生产柠檬酸工艺以其产量高、操作简便、副产物少被得到广泛的应用，同时，对其发酵底无进行了优化，并將传统诱变技术应用于生产中，使得柠檬酸产量大大提升。

黑曲霉柠檬酸代谢途径见下图1所示，在EMP作用下可将六碳糖转化为丙酮酸，可进一步被氧化脱羧生成乙酰或被脱二氧化碳生成草酰乙酸，二者进一步可合成柠檬酸。作为TCA循环的代谢产物，柠檬酸的合成需借助酶的活性，而PEK受ATP及柠檬酸的抑制作用较强，但柠檬酸逐渐积累时，柠檬酸合成酶对乙酰的亲和力也在逐步提升，因此，抑制乌头酸水解酶的活性、破坏诱导机制是提升柠檬酸积累的关键措施。

发酵法生产柠檬酸的关键技术

柠檬酸发酵的方法。总体上讲，柠檬酸的发酵方式包括了浅盘发酵工艺、固态及液态发酵工艺等类型，其中浅盘发酵工艺是柠檬酸发酵中最早的应用形式，而固态发酵工艺可充分利用农产品加工残料，可降低生产成本并降低环境污染，但其肥料成分复杂，需进一步研究相关提取工艺；液态发酵工艺具有产量大、自控性能好、效率高等优势，被广泛应用。

柠檬酸发酵的工艺条件。柠檬酸发酵过程中，菌种类型、环境条件均对其有着重要影响，一般地，柠檬酸发酵菌种多由腐烂水果中提取而来，经过生物培养获得优良菌种，并严格控制发酵过程中的温湿度、PH条件，以营造利于发酵的最佳条件。黑曲霉菌最佳发酵温度条件为30±1℃，温度偏低将影响发酵效率，而温度偏高时将产生一系列污染性杂质，甚至影响到霉菌的活性。而黑曲霉菌最佳发酵PH条件为3左右，易合成大量的柠檬酸并可有效抑制葡萄糖酸等杂质的产生。此外，培养液中的含氧量也会影响到黑曲霉菌的活性，而随着发酵过程的进行含氧量是逐渐下降的，因此可通过搅拌的方式避免含氧量降低对霉菌活性的影响。最后，采用物理或化学方法对所获得的柠檬酸进行提纯处理，分离大分子蛋白杂质，即可得到纯度较高的柠檬酸。

柠檬酸发酵工艺新进展。对于柠檬酸代谢途径的研究表明，柠檬酸的合成速度受培养环境中二氧化碳的浓度影响较大，而在不同的二氧化碳浓度条件下，柠檬酸的发酵产量及速率也受到影响，因此二氧化碳既是代谢产物，又是生物合成反应的必备原料。实验数据表明，当二氧化碳浓度高于0.90mol/L 时，将对微生物活性起到抑制作用。要想加快柠檬酸的发酵产量和质量，需要将更多的二氧化碳固定反应生成草酰乙酸，可借助基因工程提升丙酮酸的基因表达能力。此外，甲醇的存在可能会增加细胞对柠檬酸的渗透性，甲醇浓度的提升会影响到霉菌的活性，影响到柠檬酸的积累。

结论与展望

利用现代生物技术来提高柠檬酸发酵的产量和质量具有较高的技术可行性，尤其是近年来基因工程、细胞工程以及基因诱变技术的发展，对于柠檬酸发酵工艺的优化与发展提供了技术导向，开展柠檬酸生物合成途径的研究，可以有效指导生物合成途径的遗传修饰，从而调节微生物对柠檬酸的生产，增加柠檬酸产量和提高柠檬酸的积累，也为提高其他有机酸产量的研究奠定了基础。