夏玉莲，曹 云，伍显锋，曹凤勤，侯宗敏，董存柱

（海南大学 植物保护学院/热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室，海南 海口 570228）

【研究意义】细辛属植物作为中药材，主要有止咳平喘、消炎镇痛、抗菌抗病毒、抗癌细胞、抗氧化抗衰老、免疫调节（免疫活化或免疫抑制）以及对心血管和神经系统的影响等[1－2]。其中众多细辛属植物中，作为中药细辛应用的主要是辽细辛（Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag）和华细辛（Asarum sieboldiiMiq.）的干燥全草。虽然辽细辛和华细辛在医药方面以及农业方面具有很好的效果，但是辽细辛和华细辛生长缓慢，炮制工艺复杂，价格偏贵，因此其他多种地产细辛亦可入药，这类细辛统称为土细辛，双叶细辛是土细辛的一种[3－4]。双叶细辛（Asarum caulescensMaxim.）为马兜铃科（Aristolochiaceae）细辛属（Asarum）植物，别名：土细辛、乌金草，主要分布于我国陕西、甘肃、湖北、四川、贵州。民间手抄本记载双叶细辛具有行气镇痛之功效，鄂西北山区民间常用于治疗胃痛、腹痛、胸疼痛等痉挛性疼痛病症[5]。由于合成农药潜在的健康和环境风险，再加上其非选择性和抗虫性，人们对更安全和可生物降解的虫害防治替代品的需求越来越大。植物源农药因其非持久性、高选择性和低哺乳动物毒性而成为一种很有前途的替代品。目前国际上都在号召应用绿色农药替代传统农药，生产出活性高、成本便宜、对环境影响较小、对人类无害的新型农药已成为农药研究的主要内容，而植物源农药因其本身具有的大量优点使其成为新型绿色农药的研究热点[6-7]。【前人研究进展】双叶细辛通常被应用在医药方面，有民间手抄本记载双叶细辛具有行气镇痛之功效，鄂西北山区民间常用于治疗胃痛、腹痛、胸疼痛等痉挛性疼痛病症[8]。有研究[9-10]报道辽细辛的乙醇提取物具有较好体外抗炎活性。朱顺英[3]运用GC/MS测定了双叶细辛挥发油的成分，并发现了双叶细辛挥发油对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、3种酵母菌等具有良好抑制活性，可以应用临床药学研究中。在农业防治上，刘南南等[11]发现辽细辛精油对瓜类果斑病菌具有一定的抑菌效果。刘海燕等[12]发现细辛挥发油对对白菜叶斑病菌（Alternaria brassicae）、葡萄孢霉（Botrytis cinerea）、茄立枯病菌（Rhizoctonia solani）表现完全抑制作用，对人参疫霉菌（Phytophthora cactorum）、绿色木霉菌（Trichoderma viride）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata）、燕麦镰孢（Fusarium avenaceum）抑制作用相对较强。杨银书等[13]发现华细辛挥发油对媒介硬蜱的若虫和成虫、黄胸散白蚁、南方根结线虫2龄幼虫等都有一定的抑制和毒杀效果。【本研究切入点】目前关于双叶细辛的研究主要集中在药用价值以及医学研究方面，而在农业方面的研究应用报道较少[3]。从植物中分离纯化具有农用活性的天然化合物，以此先导化合物为结构模板，进行结修饰、优化、合成，从而研发出高效低毒的新型农药是植物农药的研究重点[14]。【拟解决的关键问题】双叶细辛由于分布广泛，价格相较华细辛和辽细辛便宜，因此通过对双叶细辛甲醇提取物对12种热带常见农业病原真菌展开抑菌活性研究，以期为热带农业植物病原菌防治提供理论基础及技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 双叶细辛 双叶细辛中药材购自安徽毫州皖北赵氏药业，由华南农业大学李秉涛教授鉴定，标本保存在海南大学植物保护学院，编号20200525。

1.1.2 供试菌种 苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、芒果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobromae）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、火龙果黑斑病菌（Bipolaris cactivora（Petrak）Alcorn）、水稻稻瘟菌（Pyricularia oryaeCavara）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearumSchwabe）、橡胶炭疽病菌（Colletotrichum siamense）、香蕉枯萎病菌4 号生理小种（Fusarium oxysporumf.sp.cubenseRace 4）、椰子可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。以上菌种均由海南大学植物保护学院提供，菌种保存于4 ℃冰箱，活化后备用。

1.2 方法

1.2.1 双叶细辛粗提物的制备 采用冷浸提法[15]，将采购于安徽毫州皖北赵氏药业的1 kg双叶细辛置于电热恒温鼓风干燥箱中，控温（50±2）℃烘干后，经粉碎机粉碎，将粉碎后粉末置于甲醇中浸泡，溶剂∶干粉=5∶1（体积/质量），3 d后抽滤，滤液在60 ℃减压蒸馏浓缩，即得到甲醇粗提取浸膏，残渣再加入同量的甲醇继续浸泡，反复3次，合并3次浸提膏，得到双叶细辛甲醇粗提取浸膏。将甲醇浸膏加适量的超纯水溶解，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，将各相旋转蒸发至膏状即得到石油醚相、氯仿相以及乙酸乙酯相，剩下即为水相，置于冰箱4 ℃保存，备用。

1.2.2 双叶细辛各相萃取物对植物病原真菌菌丝生长抑制活性测定 采用生长速率法[16-17]，测定双叶细辛提取物对供试病原真菌的抑菌活性。称取2 g 的双叶细辛各相萃取物分别溶解于4 mL N，N-二甲基甲酰胺中，然后在超净工作台中各取400 μL 溶解后分别融于199.6 mL 已冷却至50 ℃的PDA 培养基中，配置终质量浓度为1 mg/mL 的带药培养基，倒入直径9 cm 的培养皿中冷却凝固，以仅加入等量N，N-二甲基甲酰胺的PDA 培养基作为空白对照。取在PDA 培养基上预先培养好的病原菌，在菌落边缘用直径5 mm 的打孔器切取生长一致的菌饼，移植到培养皿的中心。每组处理重复3 次，并放置于28 ℃室内倒置培养，待菌落直径长至培养皿直径的2/3 后，用十字交叉法测量并记录菌落直径[18]，以下公式计算抑菌率：

1.2.3 双叶细辛各相萃取物对植物病原真菌菌丝生长的EC50测定 选取抑制率在70%以上的供试病原菌测定EC50。用一定量N，N-二甲基甲酰胺溶解各相待测萃取物，并用0.5%吐温-80 水溶液稀释成1 000，500，250，125，62.5 mg/mL系列质量浓度梯度的母液，将配置好的母液用0.22 μm针头过滤器过滤，然后在超净工作台中各取0.1 mL 母液加入49.9 mL 已冷却至50 ℃的PDA 培养基中，配成最终质量浓度为2，1，0.5，0.25，0.125 mg/mL的带药培养基，接种方法同1.2.2。

1.2.4 双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发相对抑制率测定 采用琼脂平板表面萌发法，取长势良好的香蕉炭疽病菌，用无菌水配制成1×107cfu/mL 的孢子悬浮液。用一定量的N，N-二甲基甲酰胺溶解各萃取相，并用0.22 μm 针头过滤器过滤，然后用0.5%吐温-80 水溶液稀释，配置成终质量浓度分别为8，4，2，1，0.5，0.25 mg/mL 的药液。用无菌打孔器打取水琼脂块置于载玻片上，待凝固后，将配制好的各质量浓度药液分取20 μL 均匀涂布于水琼脂块上，而后再取20 μL孢子悬浮液滴于培养基表面，用涂布棒涂匀，涂布完成后，将载玻片放置于底部铺有润湿滤纸片的培养皿内，密封放置于微生物培养箱中，28 ℃黑暗条件下培养6 h，含有相同量的N，N-二甲基甲酰胺和0.5%吐温-80 的无菌水作为空白对照，每个处理设3 个重复，待对照分生孢子萌发80%以上时，按下述公式计算孢子萌发率。

1.2.5 离体法测定双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉果实炭疽病的防治效果 将双叶细辛各相萃取物溶于一定量的N，N-二甲基甲酰胺中，用0.5%吐温-80水溶液稀释成10 mg/mL的溶液。挑选成熟且形状、大小比较一致、没有破损和病斑的香蕉，清洗表面，晾干备用。用喷壶将各相药液喷施到香蕉表面，每个香蕉喷施10 mL，用0.2 mg/mL 的多菌灵作为阳性对照，含有相同量的N，N-二甲基甲酰胺和0.5%吐温-80 的无菌水作为空白对照。24 h后，在香蕉表面喷洒等体积的1×107cfu/mL 香蕉炭疽病菌分生孢子悬浮液，将处理后的香蕉放入塑料盒中，用保鲜膜封好，28 ℃培养。7 d后，观察发病情况并分级，实验进行3次，每次实验3个重复。

按照以下标准进行分级，即0 级：无病；1 级：病斑面积占果实面积的5%以下；3 级：病斑面积占果实面积的6%～10%；5 级：病斑面积占果实面积的11%～25%；7 级：病斑面积占果实面积的26%～50%；9 级：病斑面积占果实面积在50%以上。计算公式如下：

1.3 数据处理

使用SPSS 25、Excel 2019软件分析处理数据进行方差分析、计算毒力回归方程及EC50。

2 结果与分析

2.1 双叶细辛各相提取物抑菌活性粗筛

通过甲醇浸泡得到甲醇粗提物125.64 g，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取后得到石油醚相32.39 g、乙酸乙酯相16.53 g、水相79.44 g。从图1和表1可以看出双叶细辛各相萃取物在1 mg/mL 的质量浓度下对供试病原菌均具有一定抑菌活性。双叶细辛甲醇粗提物对各种病原真菌的抑菌率由高到低依次为火龙果黑斑病菌100%、小麦赤霉病菌99.75%、芒果蒂腐病菌99.72%、番茄早疫病菌95.17%、香蕉炭疽病菌93.13%、苹果轮纹病菌92.20%、水稻稻瘟病菌89.31%、芒果炭疽病菌83.99%、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）83.46%、可可毛色二孢菌75.17%、橡胶炭疽病菌72.73%和香蕉枯萎病菌59.10%。双叶细辛石油醚相对各种病原真菌的抑菌率由高到低依次为香蕉炭疽病菌99.51%、芒果蒂腐病菌97.84%、小麦赤霉病菌92.37%、水稻稻瘟病菌91.23%、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）85.35%、芒果炭疽病菌85.26%、火龙果黑斑病菌81.16%、橡胶炭疽病菌80.68%、苹果轮纹病菌79.73%、番茄早疫病菌78.68%、可可毛色二孢菌74.29%和香蕉枯萎病菌55.77%。双叶细辛乙酸乙酯相抑菌活性在70%以上的由高到低依次是香蕉炭疽病菌99.95%、橡胶炭疽病菌97.09%、苹果轮纹病菌81.46%和番茄早疫病菌76.90%，对芒果蒂腐病菌抑制效果最弱，抑菌率为0.39%。可以看出双叶细辛甲醇粗提物以及石油醚相对各植物病原菌具有较好抑制活性，特别是对香蕉炭疽病菌、芒果蒂腐病菌、小麦赤霉病菌的抑制活性最好，甲醇粗提物和石油醚相的抑制率都在90%以上，乙酸乙酯相对香蕉炭疽病菌、橡胶炭疽病菌抑制活性最好，均在90%以上。

图1 双叶细辛各相萃取物对12种植物病原菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of extracts of Asarum caulescens Maxim.on 12 plant pathogens

表1 双叶细辛各相萃取物对12种植物病原菌的抑菌活性Tab.1 Antimicrobial activity of different solvent extracts of Asarum caulescens Maxim.gainst 12 plant pathogenic fungi

2.2 双叶细辛各相提取物对11种病原真菌的EC50测定

通过SPSS 25 计算出双叶细辛提取物对11 种病原真菌的EC50值[19]，结果如表2 所示。双叶细辛甲醇粗提物对11 种病原菌的EC50由小到大依次为：番茄早疫病菌0.096 mg/mL、橡胶炭疽病菌0.121 mg/mL、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）0.122 mg/mL、小麦赤霉病菌0.129 mg/mL、香蕉炭疽病菌0.143 mg/mL、芒果炭疽病菌0.158 mg/mL、芒果蒂腐病菌0.166 mg/mL、水稻稻瘟病菌0.184 mg/mL、火龙果黑斑病菌0.188 mg/mL、苹果轮纹病菌0.199 mg/mL和可可毛色二孢菌0.437 mg/mL，可以看出双叶细辛甲醇粗提物对番茄早疫病菌的抑制效果最好。双叶细辛石油醚相对11种病原菌的EC50由小到大依次为：火龙果黑斑病菌0.117 mg/mL、芒果蒂腐病菌0.138 mg/mL、小麦赤霉病菌0.157 mg/mL、苹果轮纹病菌0.177 mg/mL、橡胶炭疽病菌0.177 mg/mL、番茄早疫病菌0.193 mg/mL、香蕉炭疽病菌0.202 mg/mL、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）0.217 mg/mL、水稻稻瘟病菌0.247 mg/mL、可可毛色二孢菌0.299 mg/mL和芒果炭疽病菌0.318 mg/mL，可以看出双叶细辛石油醚相对火龙果黑斑病菌的抑制效果最好。双叶细辛乙酸乙酯相对5种病原菌的EC50由小到大依次为：香蕉炭疽病菌0.099 mg/mL、橡胶炭疽病菌0.199 mg/mL、火龙果黑斑病菌0.252 mg/mL、苹果轮纹病菌0.447 mg/mL 和番茄早疫病菌0.789 mg/mL，可以看出双叶细辛乙酸乙酯相对香蕉炭疽病菌抑制效果最好。实验结果表明，双叶细辛各相提取物对11种病原菌的菌丝生长均具有一定抑制效果，且不同萃取相对同一病原菌的抑菌效果不一样，甲醇粗提物和石油醚相抑菌活性较好，因此推测杀菌活性成分主要集中在甲醇粗提物及石油醚相中。

表2 双叶细辛各相提取物对11种植物病原菌的EC50值Tab.2 EC50 values of different solvent extracts of Asarum caulescens Maxim.gainst 11 plant pathogenic fungi

2.3 双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发相对抑制率测定

由于双叶细辛甲醇提取物各萃取相对香蕉炭疽病菌的抑制效果明显，于是进行了双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发相对抑制率的测定，结果如图2所示。由图2A可知，双叶细辛甲醇提取物对香蕉炭疽菌分生孢子萌发具有一定的抑制活性。随着提取物质量浓度的增加，其对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发的抑制作用显著增强。质量浓度在2，4，8 mg/mL时，孢子萌发相对抑制率均在60%以上，分别为65.31%、81.04%和93.28%，质量浓度为1 mg/mL 时，对孢子萌发的抑制活性明显下降，孢子萌发相对抑制率为30.48%，质量浓度为0.5 mg/mL 和0.25 mg/mL 时，基本无抑制效果，孢子萌发相对抑制率仅为5.27%和3.47%。由图2B 可知，双叶细辛石油醚萃取相对香蕉炭疽菌分生孢子萌发也具有一定的抑制活性，随着石油醚萃取相物质量浓度的增加，其对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发的抑制作用明显增强，质量浓度在2，4，8 mg/mL时，孢子萌发相对抑制率均在60%以上，分别为65.16%、73.11%和98.07%，质量浓度为1，0.5，0.25 mg/mL 时，对孢子萌发的抑制活性明显下降，孢子萌发相对抑制率分别为12.09%、7.16%和5.42%。由图2C可知，双叶细辛乙酸乙酯萃取相对香蕉炭疽菌分生孢子萌发具有一定的抑制活性，质量浓度在2，4，8 mg/mL 时，孢子萌发相对抑制率均在90%以上，分别为97.44%、97.81%和99.18%，其抑制效果优于同质量浓度下的甲醇提取物和石油醚萃取相，且与1，0.5，0.25 mg/mL质量浓度下的抑制效果差异达到显著性水平。

图2 双叶细辛各相萃取物对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发的抑制效果Fig.2 Relative inhibitory rates of the Asarum caulescens Maxim.on spore germination to Colletotrichum musa

2.4 离体法测定双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉果实炭疽病的防治效果

经过双叶细辛石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物处理过的香蕉，1 周后仍处于轻微的发病状态，只观察到少量星状病斑，发病程度明显低于经过甲醇处理过的香蕉，而空白对照组的香蕉已经出现大量病斑，开始变黑，甚至腐烂（图3）。离体法测定双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉果实炭疽病的防治效果如表3所示，经过10 mg/mL的双叶细辛甲醇提取物、石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物处理过的香蕉的病情指数分别为75.66、54.07和51.11，而空白对照处理组的香蕉的病情指数为93.65，在10 mg/mL质量浓度下的双叶细辛石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对香蕉炭疽病的防治效果分别为42.27%和45.42%，其防治效果优于0.2 mg/mL的多菌灵。

表3 离体法测定双叶细辛各相萃取物对香蕉果实炭疽病的防治效果Tab.3 Control effects of each extract of the Asarum caulescens Maxim.against Colletotrichum musae by in vitro method

图3 离体法测定双叶细辛各相萃取物对香蕉果实炭疽病的防治效果Fig.3 Control effects of each extract of the Asarum caulescens Maxim.against Colletotrichum musae by in vitro method

3 结论与讨论

国内外科研者关于中药材提取物的杀菌活性已经开展了大量的研究，从具有医药效果的中药材出发寻找具有农用活性的有效成分是植物源农药研究的一个创新方向。我国中草药资源丰富，可以为科研研究提供多样原材料，且在植物源农药的研究上也取得了很多的成果，可以作为一个植物源农药创制的新研究方向。双叶细辛作为细辛属植物中药常被用于医学研究，而在农用抑菌效果及其抑菌成分的研究鲜见报道。由致病菌引起的病害会降低农作物的产量和品质，对粮食产业造成一定的影响，因此，本研究以具有医用活性的双叶细辛为供试材料，结合当地特点，选取热带地区主要病原菌和其他作物主要病原真菌为靶标菌，以此开展双叶细辛提取物对12 种能够引起多种植物病害、造成重大农业损失的农业病原真菌抑菌活性研究，因此本试验对热带农业常见植物病害防治具有一定意义。

试验过程中采用甲醇浸泡双叶细辛，再用石油醚、乙酸乙酯、水萃取双叶细辛甲醇提取物，对双叶细辛各相萃取物进行抑菌活性检测。研究发现，双叶细辛甲醇提取物对水稻稻瘟菌、火龙果黑斑病菌、香蕉炭疽病菌、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、番茄早疫病菌、芒果蒂腐病菌、橡胶炭疽病菌、香蕉枯萎病菌12种植物病原真菌菌丝生长有明显的抑制作用。结果中双叶细辛甲醇粗提物对火龙果黑斑病菌的抑制效果高于石油醚相、乙酸乙酯相和水相，可能是由于甲醇粗提物中的活性成分在萃取过程中加热挥发导致，可以进一步实验分离提取活性成分。本试验中双叶细辛甲醇提取物对病原真菌的抑制效果具有一定的广谱性，具有开发成为植物源杀菌剂的潜力。

另外，本研究发现，双叶细辛甲醇提取物和石油醚萃取相比水相、乙酸乙酯萃取相的抑菌活性好，说明各萃取相的抑菌活性成分不同且主要抑菌活性物质在石油醚相中，可用色谱技术对其做进一步的分离，纯化出活性单体化合物，为新农药的创制提供结构新颖的先导化合物，丰富植物源天然产物农药的理论基础。研究还发现，双叶细辛提取物石油醚和乙酸乙酯萃取相1 mg/mL 的质量浓度下都对香蕉炭疽病菌表现出最好的抑制效果，抑制率均达99%以上，优于梁财等[16]研究报道的药用植物山芝麻提取物对香蕉炭疽病菌的抑菌活性报道效果，推测双叶细辛中存在对香蕉炭疽病菌具有较强抑菌活性的物质，并通过孢子萌发实验和离体实验表明双叶细辛甲醇提取物对香蕉炭疽病有一定防治效果，可以深入研究分离纯化出有活性的化合物，这一发现对将来双叶细辛开发成为防治香蕉炭疽病的植物源杀菌剂提供了一定的理论基础。本研究只对双叶细辛的抑菌活性进行了初步研究，关于双叶细辛中的抑菌活性化合物分离鉴定及其抑菌机理、作用方式等并未深入研究，并且还可以进行田间药效试验测定对农作物病害的防治效果，有望开发出高效、天然、安全的新型植物源杀菌剂。