兰玉菲 孔 怡* 于清伟 马为勇 崔 晓

（1泰安市农业科学院，山东泰安271000；2泰安市宁阳县华丰镇农技站，山东泰安271413）

灵芝属Ganoderma真菌是重要的药用真菌，隶属于真菌界（Fungi），担子菌门（Basidiomycota），伞菌亚门（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），多孔菌科（Polyporaceae），在我国已有悠久的应用历史[1]。

近年来山东省灵芝生产发展迅速，种质资源也在不断丰富，但目前对灵芝属种质资源的遗传背景和遗传多样性缺少系统研究。因此，笔者对山东省栽培灵芝菌株的遗传多样性进行研究，明确了27个栽培灵芝属菌株的分类地位，为灵芝属种质资源保护、遗传改良和新品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试灵芝菌株

供试的27个灵芝菌株中ZL81来自四川中医药科学院，紫芝、园芝1号来自寿光食用菌研究所，其他24个菌株均来自泰安市农业科学院。具体编号见表1。

表1 试验灵芝属菌株及编号

1.2 主要试剂与仪器

真菌总DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.®Fungal DNA Kit）、2×EasyTaq PCR SuperMix等购自北京全式金生物技术有限公司；常规试剂为进口分装或国产分析纯。My Cycle PCR仪，美国伯乐仪器公司。

1.3 供试培养基

PDA加富培养基：配方参照文献[2]。

1.4 菌丝体制备

切取保存在PDA加富斜面培养基上的菌丝纯培养5 mm2，接种于PDA加富平板培养基中央，25℃暗培养5～7 d，待菌丝接近生长至平板边缘后，刮取菌丝体用于基因组DNA的提取。

1.5 DNA的提取

利用DNA提取试剂盒提取真菌总DNA。具体步骤参照文献[3]。提取的总DNA于-20℃保存备用。

1.6 ITS扩增

参照文献[4]用于真菌ITS区域扩增的通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增。PCR反应体系和PCR反应程序参照文献[3]。

表2 PCR扩增ITS所用引物的核苷酸序列

1.7 PCR产物测序

PCR扩增结束后，取4μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳，将有目的条带的PCR产物送山东省农业科学院生物技术研究中心测序。

1.8 构建系统发育树

将所得DNA序列输入GenBank进行Blast检索，采用Clustalx1.81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 6.06软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中收录分离物的相应序列进行比较和分析，并构建系统进化树进行遗传距离分析。

2 结果与分析

2.1 ITS扩增

以提取的27个灵芝菌株总DNA为模板，用真菌ITS区域扩增的通用引物ITS1/ITS4对其进行PCR扩增，获得27个灵芝属菌株的ITS序列，长度约为600 bp的目的片段，与预期片段大小一致。

图1 部分灵芝菌株核糖体ITS区PCR扩增结果

2.2 ITS序列分析

测序获得27个菌株的ITS序列片段，测得的菌株序列提交到GenBank并获得登录号（表3）。根据GenBank中已有灵芝属菌株的ITS序列资料，确定ITS序列的ITS1、5.8S和ITS2的序列范围。供试灵芝属菌株的ITS序列的长度变异较大，G.lingzhisp.nov.ITS序列长度为542 bp，G.applanatumITS序列长度为560 bp，G.sienseITS序列长度为555 bp。

表3 27个灵芝属菌株ITS序列的登录号

2.3 聚类分析

根据MEGA6.06软件中的Neighbour-Joining methods，以樟芝（Autrodia comphorata）作为外类群，对27个测得的和26个来自GenBank的ITS序列进行聚类分析，建立基于ITS序列的系统进化树（图2）。结果表明，山东省栽培灵芝菌株分布于3个聚类组（Ⅰ组、Ⅳ组和Ⅴ组）。Ⅰ组为G.lingzhisp.nov.，包括35个菌株，均来自东亚地区（其中2个菌株来自日本，其余菌株分别来自中国的辽宁省、河南省、安徽省、湖北省、广东省、浙江省、四川省、山东省、福建省和江苏省），23个供试菌株均聚于该组，为山东省主要栽培菌株，组内各菌株间核苷酸一致率在99.26%～100.00%。Ⅱ组为G.multipileum，包括3个菌株，均来自亚洲热带地区。Ⅲ组为G.lucidum，包括4个菌株，来自欧洲大陆。Ⅳ组为G.applanatum，包括5个菌株，供试菌株PCSS、FCSS和YXSS聚于该组，该组内菌株核苷酸一致率非常高，PCSS、YXSS与GenBank中的2个菌株（DQ425009、DQ424996）核苷酸一致率达100%，FCSS与其他4个菌株的核苷酸一致率为99.82%；Ⅴ组为G.siense，包括3个菌株，供试ZZ菌株聚于该组，与来自上海市（DQ424982）、福建省（HQ235633）的2个菌株核苷酸一致率分别为99.28%、99.64%。结果表明，利用ITS区能够有效准确地将山东省栽培灵芝菌株分成G.lingzhisp.nov.、G.applanatum和G.siense三大类群，而与来自欧洲的G.lucidum亲缘关系较远，明确了山东省栽培灵芝菌株的分类地位。

图2 基于ITS序列构建的NJ系统发育树

2.4 基于DNA序列的种间种内遗传距离分析

根据MEGA6.06软件构建的系统进化树聚类情况，对所有菌株进行分组，计算种间种内遗传距离。由表4可以看出，灵芝属5个不同种种间遗传距离的变化在0.039～0.101，表明他们之间的遗传关系比较远；而种内遗传距离的变化在0.000～0.003，说明种内不同菌株间的遗传距离都比较小，表明种内菌株之间的遗传关系较近，并且遗传进化过程中遗传信息流动可能发生较频繁。

表4 基于DNA序列的种间种内遗传距离分析

3 小结

灵芝属Ganoderma真菌为中国传统的药用真菌，具有扶正固本，提高机体免疫力等多种功能。灵芝因其突出的保健作用、不断发现新药用功效而成为科学家的研究热点。然而灵芝属的分类比较混乱，过去一直将来自东亚的灵芝“Lingzhi”归为G.lucidum（起源于欧洲）。2012年，Cao等利用rDNA nuc-ITS，结合mt-SSU，RPB1，RPB2和TEF1-α对来自世界不同地区的灵芝菌株进行系统发育树分析，明确“Lingzhi”的分类地位，并提出来自东亚的“Lingzhi”属于一个新种G.lingzhi，同时进行形态学鉴别[5]。

笔者对获得的27个ITS序列、26个来自GenBank的ITS序列进行聚类分析，建立基于ITS序列系统进化树，结果表明，23个供试菌株均聚于G.lingzhi，其余4个菌株聚于G.applanatum和G.siense，结果与Cao等（2012）一致。

研究从DNA水平上对山东省栽培灵芝菌株的遗传多样性进行研究，明确了灵芝属种质资源的亲缘关系和分子特征，为灵芝属种质资源遗传改良、新品种的选育奠定分子基础，同时为特异种质的鉴定提供了有效方法。