林军华，吴永明，金 梅

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是临床常见的一种退行性疾病，其主要表现为认知障碍及记忆力损害，早期诊断及治疗可有效提高病人生活质量[1-3]。因而寻找有效生物标志物诊断AD具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在AD中异常表达，并可能参与AD发生及发展过程[4-5]。有研究表明，长链非编码RNA RP11-543N12.1(long non-coding RNA RP11-543N12.1，LncRNA RP11-543N12.1)在AD细胞模型中表达上调，并可能调控钙黏蛋白13基因(cadherin 13，CDH13)的表达从而参与AD发生及发展过程[6]。有研究表明，CDH13在神经系统发育过程中表达上调并可参与神经细胞迁移及血管形成过程[7]。本研究主要探讨LncRNA RP11-543N12.1与CDH13在老年AD病人中的表达及其与血清炎性因子、认知功能的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年10月—2019年10月联勤保障部队庐山康复疗养中心收治的120例AD病人为AD组，所有病人均符合美国国立神经病、语言交流障碍和卒中研究所老年性痴呆及相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)制定的AD相关诊断标准[8]。AD组120例，男80例，女40例；年龄60～75(68.59±9.65)岁；病程0.5～5.0(2.78±0.65)年。根据总体衰退量表分为轻度AD组(50例)、中度AD(39例)、重度AD(31例)[9]。所有病人均进行简易精神状态量表(MMSE)筛查，根据MMSE评分将AD病人分为轻度认知功能障碍组(60例)、中度认知功能障碍组(40例)、重度认知功能障碍组(20例)[10]。排除标准：合并心脑等器官损伤病人；视力、听力减退病人；合并2型糖尿病病人；自身免疫性疾病病人。选取同期在联勤保障部队庐山康复疗养中心体检的健康志愿者70名为对照组，男40名，女30名，年龄60～73(65.32±10.03)岁。AD组与对照组临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得联勤保障部队庐山康复疗养中心伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 采集血液样本 采集研究对象空腹肘静脉血10 mL，置于肝素抗凝管，4 ℃条件下经3 000 r/min转速离心10 min，分离血清，置于-80 ℃超低温冰箱内保存。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测RP11-543N12.1、CDH13 mRNA的表达水平 采集Trizol法(美国Invitrogen公司)提取血清中总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度。RP11-543N12.1正向引物5′-TAATGGCTGTGACCTGCGTG-3′，反向引物5′-GTCCTTGGTGCATTTGATTTCTCTG A-3′；CDH13正向引物5′-TCCCTGCAGCATCAAACCAT-3′，反向引物5′-TCGACAAATGGGGACTCACG-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT ATTC-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。参照反转录试剂盒说明书将总RNA合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，参照实时荧光定量qRT-PCR试剂盒配置反应体系，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循环。RP11-543N12.1以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，CDH13以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算RP11-543N12.1、CDH13 mRNA的相对表达量。反转录试剂盒与实时荧光定量PCR试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

1.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清炎性因子水平 采用ELISA检测血清白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 认知功能评分 采用Addenbrooke认知评估量表第3版(ACE-Ⅲ)、蒙特利尔认知评估量表(MoCA)、MMSE评分评估病人认知功能[11-12]。

2 结 果

2.1 各组血清RP11-543N12.1与CDH13 mRNA表达比较 与对照组比较，AD组血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA的表达水平明显升高(P<0.05)；与轻度AD组比较，中度AD组与重度AD组血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)；与中度AD组比较，重度AD组血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。详见表1。

表1 各组血清RP11-543N12.1与CDH13 mRNA表达量比较(±s)

2.2 AD组与对照组血清炎性因子水平比较 与对照组比较，AD组血清IL-6、IL-8、TNF-α水平明显升高(P<0.01)。详见表2。

表2 AD组与对照组血清炎性因子水平比较(±s)

2.3 AD组与对照组认知功能评分比较 与对照组比较，AD组MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA评分均明显降低(P<0.01)。详见表3。

表3 AD组与对照组认知功能评分比较(±s) 单位：分

2.4 不同认知功能障碍AD病人血清RP11-543N12.1与CDH13 mRNA表达量比较 与轻度认知功能障碍组比较，中度认知功能障碍组与重度认知功能障碍组血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表达量明显升高(P<0.05)；与中度认知功能障碍组比较，重度认知功能障碍组血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表达量明显升高(P<0.05)。详见表4。

表4 不同认知功能障碍AD病人血清RP11-543N12.1与CDH13 mRNA表达量比较(±s)

2.5 血清RP11-543N12.1、CDH13与血清炎性因子、认知功能评分的相关性分析 采用Pearson法分析血清RP11-543N12.1、CDH13与血清炎性因子、认知功能评分的相关性，结果显示，RP11-543N12.1、CDH13与IL-6、IL-8、TNF-α呈正相关(P<0.05)，RP11-543N12.1与MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA评分呈负相关(P<0.05)，CDH13与MMSE评分呈负相关(P<0.05)。详见表5。

表5 血清RP11-543N12.1、CDH13与血清炎性因子、认知功能评分的相关性分析

3 讨 论

AD的主要病理学特征为海马、大脑皮层中突触与神经元呈渐进性缺失，其主要发病机制为神经细胞外不可溶性的β-淀粉样蛋白沉积形成老年斑与神经细胞内微管相关Tau蛋白高度磷酸化聚集、神经原纤维缠结。有研究表明，LncRNA可通过竞争性结合miRNA而调控其靶基因表达，还可与蛋白相结合从而参与AD发生及发展过程[13-15]。但LncRNA在AD病人血清中的表达及其临床意义尚未完全阐明。

本研究结果显示，AD病人血清RP11-543N12.1与CDH13mRNA的表达水平明显升高，随着疾病严重程度的增加，AD病人血清RP11-543N12.1与CDH13mRNA的表达水平明显升高，提示RP11-543N12.1与CDH13mRNA表达量升高可能参与AD发生及发展过程。有研究表明，CDH13在神经元识别及相互作用中发挥重要作用[16]。分析原因可能是RP11-543N12.1水平升高可促进CDH13的表达上调从而造成AD病人神经功能损伤。有研究表明，AD病人脑组织中IL-6、IL-8、TNF-α水平升高，表明AD病人脑组织存在严重的炎症反应[17]。与上述研究结果相似，本研究结果显示，AD病人血清IL-6、IL-8、TNF-α水平升高，进一步研究显示RP11-543N12.1、CDH13与IL-6、IL-8、TNF-α呈正相关，提示AD病人出现的神经慢性退行性改变与RP11-543N12.1、CDH13表达量升高有关，其表达量升高可能促进脑内免疫及炎症反应从而导致神经细胞损伤及细胞凋亡。

本研究结果显示，AD组MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA评分明显低于对照组，进一步研究显示RP11-543N12.1与MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA评分呈负相关，CDH13与MMSE评分呈负相关，提示RP11-543N12.1、CDH13表达量升高与AD病人认知功能障碍有关。同时本研究根据MMSE评分将AD病人分为轻度认知功能障碍组、中度认知功能障碍组、重度认知功能障碍组，结果显示不同认知功能障碍病人血清RP11-543N12.1、CDH13表达量升高，且随着认知功能障碍程度的加重，病人血清RP11-543N12.1、CDH13mRNA表达量升高，提示RP11-543N12.1、CDH13mRNA表达量升高可能参与AD病人认知功能障碍发生过程。

综上所述，RP11-543N12.1与CDH13mRNA在老年AD病人中的表达量升高，其表达量与炎性因子、认知功能评分密切相关，并可能作为AD诊断及评估疾病进展的重要指标，其表达量升高还可能增加AD病人认知功能障碍的发生风险。