刘俊

（信阳农林学院，河南 信阳 464000）

酸模（Rumex acetosa L.），又名野菠菜、山大黄，是蓼科酸模属多年生草本植物，为民间传统药用植物，全草供药用[1]。该属的羊蹄、钝叶酸模、巴天酸模、皱叶酸模等均作为草药“土大黄”广泛使用，具有清热解毒、行瘀止血、杀菌止痒等功效，用于治疗疥癣和多种出血症[2]。蓼科酸模属植物的主要化学成分为蒽醌类、黄酮类、萘、二苯乙烯、香豆素及有机酸等[3]，其中黄酮化合物具有抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、抗抑郁、扩张血管、降低血糖等多种功能[4-6]，是一种天然抗氧化剂和天然保健原料，广泛应用于医学、食品营养学等领域，具有广阔的市场前景[7-8]。本试验采用微波辅助醇提法提取酸模根茎中的黄酮，并通过响应面法优化了提取工艺；借助试验设计软件Design-Expert 8.0.6.1 软件，采用Box-Behnken 模式对各主要影响因素之间的单一作用进行了研究，得出最佳的提取工艺参数，为酸模资源的深度研究与开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸模根茎，自行采摘，产地为河南信阳；无水乙醇（分析纯），购自北京化工厂；芦丁标准品，购自中国药品生物制品鉴定所；硝酸铝、氢氧化钠(分析纯），均购自天津市化学制剂三厂)；石油醚、亚硝酸钠(分析纯），均购自国药集团化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；UV-1600 型紫外可见光分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；微波萃取设备，广州万程微波设备有限公司；SF-170 型高速粉碎机，上海中药机械厂；电热恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；80-2 型电动离心机，江苏恒丰仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 酸模根茎黄酮提取工艺流程

酸模干燥根茎→粉碎，过筛→石油醚浸泡，去除色素→70%乙醇浸泡→过滤，留取上清液。

1.3.2 主要工艺操作要点

（1）原料处理。将预先清理、切段处理的新采摘酸模根茎放入80 ℃鼓风干燥箱中烘干，然后使用粉碎机将其粉碎，过60 目筛，再装入封口袋中，置于干燥器中保存备用。

（2）芦丁标准曲线的制作。采用亚硝酸钠—硝酸铝显色法[5]测定黄酮含量。分别准确移取0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，0.1 mg/mL 的芦丁标准液，于6 支干净的10 mL 容量瓶中，加入70%乙醇溶液补足至5 mL。加入5%NaNO2溶液0.3 mL，震荡摇匀，放置8 min；然后加入10%Al (NO3)3溶液0.3 mL，震荡摇匀，静置8 min；再加入4%NaOH 4 mL，用70%乙醇定容到10 mL，震荡摇匀，放置20 min 后，于510 nm 波长处测定吸光度，绘制芦丁标准曲线，拟合得回归方程：A=16.55×C－0.0165，R2=0.9984（线性范围：0～0.05 mg/mL）。

（3）样品溶液的制备。在确定料液比下，以70%乙醇溶液作提取溶剂，在设置好的温度、微波强度下提取一定时间，趁热抽滤，再移至100 mL 容量瓶中并用70%乙醇定容，制成样品溶液。

（4）黄酮提取率的测定。移取5 mL 的待测提取液于10 mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，震荡摇匀，放置8 min；然后加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，震荡摇匀，静置8 min；再加入4%NaOH 4 mL，用70%乙醇定容到10 mL，震荡摇匀，放置20 min 后，以不加提取液组为对照组，于510 nm 波长处测吸光度，根据吸光度和芦丁标准曲线计算酸模根黄酮提取率，并按下式计算：W=×100%（C为提取液中黄酮的质量浓度，单位为mg/mL；V为提取液的体积，单位为mL，m为酸模根茎粉末质量，单位为g）。

1.3.3 单因素试验

黄酮类化合物易溶于醇类溶剂，本试验采用微波辅助醇提法提取酸模中黄酮，分别考察了提取时间、提取温度、液料比三因素对黄酮提取率的影响。

1.4 响应面试验设计

1.4.1 单因素试验结果与试验水平的确定

本试验固定微波强度，以70%乙醇溶液作为溶剂，分别考察了提取时间（0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h）、提取温度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80℃）、液料比（10∶1 mL/g、20∶1 mL/g、30∶1 mL/g、40∶1 mL/g、50∶1 mL/g）三个因素对酸模黄酮提取率的影响。最终确定三因素的三水平为提取时间（1 h、1.5 h、2 h）、提取温度（50 ℃、60 ℃、70 ℃）、液料比（20∶1 mL/g、30∶1 mL/g、40∶1 mL/g）。

1.4.2 响应面试验设计

在“1.4.1 单因素试验结果与试验水平的确定”的基础上，运用Design-Expert8.0.6.1 软件进行Box-Behnken 设计，以黄酮提取率为响应值，采用三因素三水平优化酸模黄酮的提取工艺，各因素水平设计见表1。

表1 响应面实验设计因素水平表

2 试验结果与数据分析

2.1 响应面试验结果分析

2.1.1 试验结果与回归方程

利用Design-Expert 8.0.6.1 软件设计试验优化酸模黄酮的提取条件，由数据分析得到黄酮提取率自变量与相关变量之间关系的拟合方程为：提取率(%)=5.04+0.26A+0.059B+0.14C-0.18AB-0.14AC-0.042BC-0.23A2-0.30B2-0.11C2。通过该方程可以计算实验的预测值，如表2 所示。

表2 响应面试验设计与结果

2.1.2 回归模型的方差分析

从表3 中拟合优度、方差的分析结果可知，该模型具有极低的p 值(p<0.01)，表明该模型具有显著性；而失拟项p 值大于0.05，表明该方程对试验拟合情况好，试验误差小。相关系数R2 为0.9481，表明酸模黄酮提取率的实测值与预测值之间非常接近，模型预测性好。此外，系数变异值CV(2.43%)较低，表明实验的精确度较高，重复性好。对酸模黄酮提取的影响极显著的因素有一次项A、C 和二次项A2、B2及交互项BC。通过比较F 值的大小，可得出影响酸模黄酮提取效果的因素顺序为：提取时间(A)＞液料比(C)＞提取温度(B)。

表3 二次响应面回归模型方差分析

2.2 最佳提取工艺和验证

由响应面实验的优化得到最佳工艺条件：提取时间为1.74 h、提取温度为59.34 ℃、液料比为33.76∶1 mL/g。为了便于实际操作，将酸模根茎黄酮的最佳提取工艺参数修正为：1.8 h，提取温度60 ℃，液料比34∶1 mL/g。在改进条件下，进行三组重复性验证实验，提取率依次为4.97%、5.05%、5.16%，3 组均值为5.09%，与预测值5.12%十分接近，表明该模型预测性很好。

3 结论

本试验采用响应面法优化酸模根茎中黄酮的提取工艺，运用Design-Expert 8.0.6.1 软件进行Box-Behnken 中心组合试验设计，最终确定酸模根茎中黄酮的最佳提取工艺为：1.8 h，提取温度60 ℃，液料比34∶1 mL/g。在此基础上进行验证试验，实测酸模根茎黄酮提取率的平均值为5.09%，十分接近预测值5.12%，说明该模型能较好地预测各因素与酸模根茎黄酮提取率之间的关系。