张浩 王拥军 桑敬伟 张文 杨卫兵 高雁卿 张紫机

(1安阳市人民医院骨科，河南 安阳 455000；2中山大学第一附属医院关节外科)

骨髓间充质干细胞(hBMSCs)是一类具有多向分化潜能的干细胞，在特定环境下可诱导分化成为成骨细胞，调控骨的生长发育。因hBMSCs具有来源广泛、易分离培养和分化潜能大等特点，被认为是治疗骨质疏松等骨组织损伤修复的理想种子细胞〔1〕。然而，如何使hBMSCs单向成骨分化一直是制约临床修复效率的关键。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA，可与相关靶基因3′UTR区结合抑制其翻译进而影响细胞的增殖、凋亡和分化等多种生物学过程。研究〔2～4〕证实，miRNA在hBMSCs成骨分化过程中发挥着重要作用。有学者发现，miR-224在hBMSCs成骨分化过程中低表达，但其具体的作用及调控机制尚不清楚〔5〕。因此，本研究通过体外培养hBMSCs并诱导其成骨分化后，采用常规生物学手段上调miR-224表达，观察其对hBMSCs成骨分化的影响，并通过靶基因预测软件预测相关靶基因，探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 人hBMSCs、诱导成骨分化的DMEM培养液、hBMSCs培养液ORICellTM和Opti-MEM培养液购自中国赛业生物公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，胰蛋白酶购自美国Sigma公司。成骨特异性转录因子(Runx)2、骨钙素(OCN)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、SMAD同源物(Smad4)一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自英国Abcam公司。miR-224模拟物(mimics)、miR-control、Smad4 siRNA干扰序列和阴性对照序列均购自上海吉凯公司，脂质体2000购于美国Introvigen公司。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自美国Omega公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒、逆转录试剂盒、RNA抽提试剂盒和电化学发光(ECL)检测试剂盒购自上海碧云天公司，碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒购自南京建成生物公司。……