何峰，赵兴昌，梁清洋，谢克恭，唐毓金，刘佳★

（1.右江民族医学院，广西 百色；2.安徽省明光市人民医院 骨科，安徽 明光；3.右江民族医学院附属医院，广西 百色）

0 引言

Cre-loxP[1]系统是一种条件性基因敲除（Conditional Knockout,CKO）技术，Cre 表示一种特异性位点重组酶，loxP就是一小段DNA 序列，大约长34 bp。Cre 重组酶能介导两个34 bp 的loxP 之间的位点特异性重组，使loxP 位点间的序列位点或基因被删除。CKO 与全身性基因敲除（Knockout,KO）法不同，靶基因只局限在某一特定的细胞、组织、器官或生长的某一特定阶段，这种技术最大优势就是具有时空可控性和组织特异性[2]。经过十多年的快速发展，这项技术已经可以方便地为我们实现对小鼠特定发育阶段或特定组织中的靶基因随意编辑了。最近几年，发现应用Cre-loxP 基因敲除技术造模研究膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis,KOA）[3]明显增加。随着社会老龄化，KOA 的病人越来越多，至2020 年已经成为导致老年人慢性残疾的第四大罪魁祸首。KOA 对人类膝关节威胁之大已成为广大骨科医生的共识，它属于随年龄增长缓慢退变性疾病。当前经过调查国内外大量相关文献，综合表明KOA 的发生是一个长期复杂的过程，其最终共同的病理特点主要是膝关节的软骨及软骨下骨组织无菌性炎症反应、软骨细胞凋亡破坏和软骨细胞外基质的不断丢失伴有骨赘增生。运用新发现的基因做CKO 小鼠模型对于KOA 信号通路的研究有着重要意义[4]，也是Cre-loxP 基因敲除技术在KOA 的研究上有着无可比拟的优势所在，同时也拓展了我们对于KOA 的干预思路。近年来Cre-loxP 基因敲除技术发展日趋成熟，对生物体内的靶点进行基因敲除有助于更清楚地研究其功能，对临床治疗同样意义非凡。

1 Cre-loxP 基因编辑技术

1.1 Cre-loxP 发展历程

在上世纪80 年代，科学家们首次成功分离并在体外培养出了胚胎干细胞，Thompsson 等人在分子水平上利用相同来源的基因片段重新互补组合，即为基因敲除技术的核心所在。利用新产生的DNA 双螺旋结构功能截然不同，某些片段的功能可能丢失的特点，设计出了基因敲除小鼠模型。2007年的诺贝尔生理学或医学奖[5]授予了在基因修饰和老鼠胚胎干细胞技术研究领域取得重大突破的三位科学家，他们的研究成果就是发现了特殊的基因修饰技术和鼠胚胎干细胞分离技术，之后在这项技术上创造出了“基因敲除”。初期的基因敲除技术也就说通常所说的全身基因敲除（KO），后来经过技术改进逐渐发展为CKO。目前实际应用比较多的是Cre-Loxp 技术和CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat,CRISPR）[6]/Cas9（相关蛋白核酸酶9）（CRISPR associated nuclease 9,Cas 9）技术[7]，还有最新的ZFN 和TAILEN 技术。

1.2 Cre-loxP 系统作用机制

首先经由基因打靶技术在基因组的靶位点上插入两个同向排列的1oxP 短片段基因，此时的靶基因尚未达到被敲除的目的，相关小鼠的表型仍同野生型一样。Cre 基因的特点是能够表达一种特别重要的酶叫做Cre 重组酶，编辑了不同Cre 重组酶的各种组织特异性的小鼠就是Cre 转基因工具鼠，它的重要作用就是产生类似剪刀的切除功能，它能特异性识别1oxP 系列，在loxP 指引下能准确切除目标基因两端同向1oxP 区间内的一整段基因片段，还能使敲除后的片段环化，余下的两条链重新连接；最后将设计好的“loxP-floxed”小鼠与Cre 转基因工具鼠杂交，杂交后产生的子代小鼠中将有一部分体内同时携带“loxP-floxed”靶基因和Cre 基因，它就是CKO 小鼠模型。在这个过程中，正是Cre 基因为我们达到了在特定组织或器官敲除靶基因的目的，因为只要把Cre 重组酶的编码序列置于某种特定基因启动子下，它就能在特定的目标组织或器官中表达，凡是表达了Cre 的细胞，两个同向排列的1oxP 间的靶基因都会被切除，这样就实现了靶基因在何时何地发生敲除的可控性。Cre-loxP 系统作用机制[8]见图1。

图1 Cre-loxP 系统作用机制简图

1.3 Cre-loxP 与其他基因编辑技术的比较

Cre-loxP CKO 较其他基因敲除技术的优势之处在于可以运用一种靶基因编辑的“loxP-floxed”小鼠与不同Cre 工具鼠搭配，达到灵活运用研究靶基因在不同组织器官中的发生机制和影响，还能避免重要靶基因被敲除后小鼠的过早死亡现象。

基因诱捕技术是在小鼠基因敲除相关研究领域中又一重大发现。原理是通过一定的技术手段先随机破坏靶基因，那么其对应的功能也就丧失了，从而实现大规模基因敲除策略。运用这项技术不但节约成本而且快速有效[9]；但也有很多弊端，如在基因诱捕过程中发生载体的部分片段丢失；还有可能随机发生一大段基因的误删除等情况。

CRISPR/Cas9 基因编辑技术有多点编辑效率高、可操纵性强等优势，但存在脱靶、错配的情况，只有进一步提高安全性和降低操作成本才能被广泛应用。

虽然目前Cre-loxP CKO 技术被应用较多，但也存在诸多尚待解决的问题如小鼠的扩繁过程繁琐；Flox 纯合并且Cre杂合的小鼠模型获得周期太长；得到批量模型动物付出的成本较高；Cre 重组酶在体内造成严重的细胞毒作用等。

总之，Cre-loxP CKO 基因敲除技术为我们研究探索靶基因在体内的功能打开了另一扇门，利用Cre-loxP 系统来生产特定基因敲除小鼠仍是目前一种强大且已成熟的策略。

2 膝骨关节炎

膝骨关节炎（KOA）对人类膝关节威胁之大已为广大骨科医生所认同，国际骨科大会曾多次讨论过该课题。KOA 最常发生于中老年人群，呈现病程长、进展慢的特点，晚期对膝关节破坏严重。病理特征为软骨细胞被持续破坏而数量减少，软骨下骨暴露且硬化重建。至2020 年已经成为导致老年人慢性残疾的第四大罪魁祸首。当前经过调查国内外大量相关文献，综合表明KOA 的发生是一个复杂的长期综合作用导致的结果，是多因素叠加后相互影响所致的疾病，但是进展是缓慢且渐进的，其最终共同的病理特点主要都是无菌性炎症反应、软骨细胞凋亡破坏和软骨细胞外基质的不断丢失伴有骨赘增生。其中基质是指关节软骨细胞之外的部分，它的减少是占据主导地位的，因为软骨细胞外基质直接营养软骨细胞，它发生了分解代谢，则软骨细胞生存困难，于是软骨降解而最终导致关节炎。

3 Cre-loxP 技术在KOA 相关基因研究中的应用

探索KOA 相关基因的致病机制已成为当前研究的热点，近5 年来关于利用CKO 小鼠来作为KOA 研究模型的文献数量呈逐年上涨的趋势。在PUBMED 对2015年1月1日至2020年6月30日的文献以关键词mouse/mice 和osteoarthritis/OA 检索，有40 篇用到基因敲除小鼠，排除了8篇不完全相关文献，余下的24 篇[相关基因：TNFα、GRK5、Smo、HTRA1、microRNA-485-5p、Elf3、IkappaBzeta、Fyn、ERRγ、CCL2/CCR2、Crtac1、HSPG-2、Dio2、BATF、TCF7L2、JNK-2、BMAL1、HSP70、TRPA1、Notch、Bach1、Drosha、ECS、（HIF）-2a] 是关于研究诱导型KOA 基因的，8 篇（相关基因：Sost、FGFR3、IL-4、Enpp1、A2AR、Matn1、MTs、DUSP1）是关于研究预防型KOA 基因的。

这些新筛选的基因是目前骨性关节炎研究领域的热点，系统归类最新发现的CKO 基因对于进一步研究它们在KOA中的作用机制是必要的。本文中基因符号的单词书写形式因为没有统一标准，所以只能根据它的来源文献确定，故而这些符号与官方文书中的写法可能有所不同，所有统计的文献中关于CKO 基因的研究效果评价都是建立在与野生型小鼠的效果对照比较而得出的结论，具有客观性。但是其真实效果还应该得到进一步扩大认证才可最终确定，这样才更具有科学的说服力。但是，经过仔细研究文献发现其中部分文献对于Sost 这个基因的功能研究还存在争议。Veronesi F 等人[10]研究后得出这样一个结论，认为对KOA 无影响基因中就包括Sost 基因。而Li J 等人[11]却在自己的研究结论中阐明Sost 是KOA 的一个保护型基因。为了解决这一争议问题还需更深入地开展研究以证实其确切功能。

4 Cre-loxP 技术在KOA 领域的应用前景

4.1 信号通路的研究

Cre-loxP 技术在动物体内水平研究基因功能是一种高效的方法，而且也是研究目的基因表达变化和调控机制信号通路的有效手段。近些年来世界许多骨科重点实验室都在基因层面尝试研究KOA 相关的基因及其信号传导通路，已通过此项技术发现了较多影响KOA 的信号通路。如Wnt/β-catenin、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target Of Rapamycin,mTORC）信号通路等。如果在对这些重要信号通路的研究中发现可以解决KOA 治疗的靶点，对临床来说意义重大。

4.2 KOA 动物模型的建立

我们知道KOA 是一种与年龄相关的退行性疾病，想要更好地研究KOA 发病机制及防治办法，前提条件是建立接近自然病理状态的动物KOA 模型，这样才能获得对病理机制和临床治疗研究的更为准确的结果。目前国际KOA 研究领域构建的实验动物模型主要是Cre-loxP 条件基因敲除小鼠，它与经典的动物模型相比有明显的优势，如对于KOA 研究除了这种模型小鼠在基因修饰方面无可比拟的优势以外，小鼠的遗传背景清晰、混杂因素少、疾病可复制性好、总体可控及操作相对简单等好处都是显而易见。但是，目前购买转基因动物的价格昂贵，饲养时对环境及饮食要求高，成本增加。而且建立较大体型的转基因动物技术尚未突破，目前小鼠因体积较小造成手术操作难度加大、以及基因检测鉴定程序繁琐过程复杂等，这些无疑都限制了它的广泛应用。相信随着对Cre-loxP 技术更深入地研究，KOA 模型动物的培育技术会不断改进，成本也会逐渐下降，操作过程也会更加简单方便，相信这项技术一定会为KOA 的深入研究做出更大贡献。