徐晓莹 史文凯 姜作真 贺加贝 曹亚男 刘燕英

摘 要：总结概括了微藻原生质体制备技术，并对原生质体制备过程中的影响因素进行了深入探讨。在此基础上，论述了原生质体制备技术在微藻中的应用研究进展，展望了该技术的应用前景。

关键词：微藻;原生质体制备;研究进展

中图分类号：S917

1 原生质体概述

原生质体是指细胞完全去除细胞壁后被细胞膜所包围的、具活力的细胞。原生质体担负着细胞的所有生命活动，是细胞生命活动的物质基础[1]。在原生质体基础上可进行一系列技术操作，主要包括原生质体再生、原生质体融合和转基因等培育选育新类型的生物技术等。上述技术的关键是对细胞壁进行消化，以形成大量有活力的原生质体，并使原生质体高效地再生细胞壁，恢复到正常细胞状态。原生质体结构简单、发育同步性好、遗传物质易于进入细胞、易于再生分化完整植株等特点[2]使原生质体的研究越来越受到重视。另外，原生质体培养技术与有关分子、细胞和遗传等学科相互交叉渗透，为高等植物的分子水平和细胞水平遗传操作提供理想的实验体系。

2 微藻原生质体制备技术

早在1892年，藻类原生质体首次使用机械法被分离出来，但该机械法靠手工操作，难度大，只限于能广泛发生质壁分离的组织，对胶质物含量较高的藻类分离效果不佳，原生质体的得率低。后来研究者发现酶液能降解细胞壁[3]，开辟了酶法制备原生质体的新途径。酶具有很强的专一性，同时水解条件十分温和，在细胞能够承受的范围之内，对细胞伤害较小，原生质体的产率较高，可以获得大量有活力的原生质体，从而为研究提供必要原生质体材料[4]。

早期酶法制备原生质体过程中的酶主要来源于生物体内，如微生物来源的微藻解壁酶（琼胶酶、褐藻酸酶、卡拉胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、紫菜聚糖酶[5-6]等）和动物来源的微藻解壁酶（褐藻酸酶[7]、鲍酶、海螺酶Ⅲ、石鳖酶和笠贝酶[8]）。目前，广泛用于原生质体制备的酶主要有纤维素酶[4]、半纤维素酶、果胶酶[4]、几丁质酶、蛋白酶、崩溃酶、离析酶等。

3 酶法制备原生质体的影响因素

影响微藻原生质体制备的因素有很多，如酶的种类、浓度、酶解时间、酶解液pH值、藻细胞生长时期等因素。根据不同藻类细胞壁成分的不同，原生质体制备过程中需针对性地采用不同的水解酶。如蓝藻的细胞壁含有黏肽，因而可用溶菌酶处理获得蓝藻细胞的原生质体;绿藻的细胞壁主要成分为纤维素，因此可以用纤维素酶处理而获得原生质体[8-9];而红球藻细胞壁中含有糖蛋白分子及少量纤维素或几丁质[10-11]，多糖降解酶去壁效果并不好[12]。

酶中往往含有对原生质体有害的物质，因此在去壁过程中，酶浓度并非越高越好，若酶浓度过大，细胞脱壁太彻底甚至对已脱壁的原生质体产生破坏作用，则大大降低原生质体的再生率。另外，实践表明，控制合适的酶解时间对原生质体的制备也至关重要，如果酶处理时间太短，所获得的原生质体量少而不能满足实验需要，但长时间的酶解又会破坏早期释放的原生质体膜，导致原生质体破碎或再生率降低，从而影响原生质体的产量和细胞壁再生的能力[13]。

合适的酶解温度及酶解液pH值是水解酶发挥作用的重要因素。酶解温度直接影响酶促反应的速度，有研究表明，酶处理一般在10～30 ℃下进行90 min。不同水解酶的最适温度也存在差异，如果胶酶的最适温度为25 ℃，而纤维素酶和半纤维素酶的适宜温度为30 ℃。酶解液pH值不仅影响酶的活力和底物的特性，改变溶壁效果，而且影响已脱壁原生质体的稳定性。所以原生质体制备的最适pH值与制备过程中所用酶的种类以及细胞壁的成分密切相关[14]。

原生质体的制备效率受藻细胞不同生长时期的影响较大，对数期的藻细胞代谢活跃，生长速率高，群体细胞的化学组成、形态及生理特征比较一致，并且細胞壁较薄，因此，使用对数生长期的细胞制备原生质体时产率最高[4]。

藻细胞密度也对酶解效果有一定的影响，通过对不同密度藻细胞进行酶处理相同时间比较发现，在一定范围内，原生质体的制备率随着细胞密度的增加而增加，原因可能是藻细胞密度高，相互之间接触比较频繁，更有利于酶混合液的消化作用[15]。

众多研究表明，阻碍微藻原生质体制备技术发展的主要障碍在于微藻细胞壁成分的多样性和复杂性。各种微藻细胞壁的组成差异巨大，甚至不同藻种、不同生长环境微藻细胞壁组成不尽相同，使得各种微藻原生质体的制备条件也各不相同。因此要结合微藻细胞壁成分，选取一种或多种酶组成的混合酶来高效降解细胞壁，同时酶解时要考虑多重酶解环境因素的共同影响，是解决这一问题的有效途径。张莉等[16]从烟台海滨水域分离出一株四爿藻属（Tetraselmis sp.）的藻株，应用响应曲面设计方法研究了混合酶的比例、浓度、缓冲液pH值等多参数的综合效应，确定了该藻株原生质体制备的最适条件，得到了81.5%的理论最高制备率，与试验验证的80.5%的制备率误差为1.24%，该研究为优化单细胞微藻原生质体制备条件提供了通用性模式。

4 藻类原生质体制备技术研究进展

微藻的细胞操作始于20世纪50年代末期，Fushs成功分离得到一种丝状蓝藻——颤藻（Oscillatoria amoena）的原生质体[2]。1976年Berliner等[9]分离得到鼓藻的原生质体;1977年Berliner[17]成功制备小球藻（Chlorella Vulgaris）的原生质体;1989年Davies等[18]制备得到丝状蓝藻（Ulothrix gigas）的原生质体。随后，其它种类微藻的原生质体也相继制备成功。其中绝大部分属于绿藻门（如布朗葡萄藻、衣藻、小球藻、雨生红球藻、亚心形扁藻等），除此之外，只有少数几株蓝藻门（螺旋藻、项圈藻等）和红藻门（紫球藻等）的藻株原生质体成功分离。表1列出了2000年以来部分微藻原生质体的制备情况。

随着越来越多的藻类原生质体被成功分離，研究者对酶解去壁过程以及细胞壁超微结构也进行了详细的研究。Yamada等[27]利用透射显微技术和扫描显微技术对椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea）细胞壁的酶解过程中细胞超微结构进行了较为详细的研究，试图解释藻细胞能够形成原生质体以及阐述细胞壁结构和细胞稳定性之间的关系。Yamada等[28]的另一研究发现，小球藻的细胞壁结构可以分为三种类型，分别为胞壁外有三层的外层结构、胞壁外有一薄的单层结构和胞壁外没有外层结构。经酶解实验表明，只有胞壁外有一薄的单层结构类型细胞壁的小球藻株可以用酶解的方法直接形成原生质体。

对于生活史中多种细胞形态交互变化的雨生红球藻，其细胞壁是由糖蛋白分子以及少量的纤维素和几丁质组成，所以Tjahjono等[29]提出以蛋白酶K来制备其原生质体。随后叶涛等[24]等用酸性缓冲液、EDTA和二硫苏糖醇配制而成的预处理剂处理雨生红球藻细胞，然后以纤维素酶、蜗牛酶和酸性缓冲液组成的复合高渗酶溶液来分离得到原生质体，制备率可达68.3%。但是，在雨生红球藻生活史中存在包括游动细胞和不动细胞等多种细胞类型[30-32]，其细胞壁结构及组成均存在较大差异。游动细胞原生质体外仅被透明、凝胶状的胞外基质所包被，而不动细胞形成了厚而致密的细胞壁[33]。Triki等[34]曾提出用蛋白酶K和纤维素酶分别处理雨生红球藻游动细胞和不动细胞，但并没有详细分析二者的区别。以往这些原生质体制备的研究中并未针对雨生红球藻生活史中特定细胞，且需要进行破壁预处理，方法繁琐，耗时较长，所需酶种类较多，这些问题使雨生红球藻原生质体后续的遗传等操作受到了极大的限制。直到2017年，Cheng等[35]首次将雨生红球藻生活史中游动细胞和不动细胞均应用于原生质体制备，结果发现蛋白酶K对于两种细胞原生质体的释放均有效，其中游动细胞经蛋白酶K处理后可获得90%的原生质体释放效率;而不动细胞酶解过程中同时添加了纤维素酶和蜗牛酶来促进纤维素细胞壁的降解，但因次生细胞壁难以降解，原生质体释放效率仅为40%。该研究首次报道了酶解液中添加Ca2+能有效提高雨生红球藻游动细胞的稳定性，进而提高原生质体制备效率。

5 总结与展望

由于微藻复杂多样的细胞壁组成和结构，微藻原生质体制备的相关技术发展较为缓慢，其应用仍处于发展阶段。微藻原生质体的成功制备为其细胞和分子水平的操作提供了良好的实验操作体系，将带动由原生质体出发而进行的有关微藻生理、生化、遗传学等多种实验技术的发展，对微藻养殖、遗传育种以及高附加值产物的生产都有重要的意义。

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Abstract：The development of microalgae protoplast preparation technology was summarized and the influencing factors during the preparation process was discussed.Moreover，the research progress of protoplast preparation technology in microalgae was also discussed.

Key words：microalgae;protoplast preparation;research progress

（收稿日期：2021-07-15）