王宁 周金旭 徐浩 王秀利

摘 要：为深入了解简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记在水产养殖中的应用情况，为今后开展水产养殖动物的分子标记辅助育种，综述了SSR的开发方法以及SSR在种群的遗传多样性分析、数量性状的定位、DNA指纹图谱构建、遗传连锁图谱构建等方面的研究进展。SSR分子标记在水产养殖动物的种质鉴定、遗传距离分析、分子标记辅助育种等方面具有广阔的应用前景。

关键词：SSR;分子标记;水产养殖

SSR即简单重复序列，也称作微卫星DNA （ Microsatellite DNA）或是短串联重复序列 （Short tandem repeats）[1]。因为SSR具有丰富的多态性，使其成为继单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）之后最有用的用于遗传研究的DNA标记之一[2]。现阶段已经开发多种分子标记手段[3]，如单核苷酸多态性标记（SNP）、限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、随机扩增多态DNA标记（Random amplified polymorphic，RAPD）、扩增片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）和微卫星标记（SSR）等，且已广泛应用于动植物遗传研究中[4-8]。SSR具有其他分子标记不可比拟的优势[9]，使其在动物分子标记育种中具有很高的研究和应用潜力。近年来， SSR標记技术作为重要的分子标记育种技术，已广泛应用于水产养殖行业中[10-12]。本文对SSR在水产养殖领域的研究和应用进展进行了综述。

1 SSR简介

1.1 SSR的定义

SSR是指含极短单位（通常小于10 bp）串联重复序列的基因组DNA片段，通常重复相对较少的次数，以不同的长度散布在真核生物基因组中[1]。SSR标记技术是基于特定引物PCR扩增的一项分子标记技术，属于第二代分子标记技术，由Litt和Luty最早在1989年研究心肌肌动蛋白基因时提出[13]。其通常由1～6 bp串联重复的核苷酸为核心序列，例如（AC）n、（GT）n、（AT）n和（ATT）n等，n为核心序列的重复次数，一般为10～60次不等。由于其核心序列的重复次数不同和核心序列不完全相同，使SSR具有丰富的多态性。因为SSR两端的单拷贝序列具有保守性，所以可根据碱基互补配对原则设计出特异性引物，运用PCR技术对含有SSR的基因组DNA序列进行扩增，扩增的目的片段可通过电泳等方式分析其多态性[14-16]。

1.2 SSR的优缺点

鉴于前文所述SSR的构成特点，SSR作为标记技术在开发和利用中展现出明显的优缺点。SSR的优点在于：（1）呈孟德尔共显性遗传，不易被选择淘汰掉。（2）随机散布在真核生物的基因组中，数量丰富。如Beckman等[17]研究发现人类基因组中大约每6 kb就存在一个SSR位点，且SSR既存在于编码区也存在于非编码区。 （3）高效，只需少量DNA就可以进行PCR扩增分析鉴定分析[18]。（4）其核心序列种类多，重复程度多样，使其具有高度的多态性。（5）种属间部分物种可以共用，具有良好的通用性。如杨璞等[19]用虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）的SSR引物在栉孔扇贝（Chlamys farreri）的基因组DNA上扩增出了相应的SSR位点。（6）不同的SSR位点由不同的引物序列决定，有利于更高效、更优化的引物开发。

然而现阶段SSR在使用过程中也会展现出一些缺陷：对于基因序列完全未知的物种而言，SSR位点引物开发是一大难点，这需要构建基因组文库或者全基因组测序，需要花费大量的物力、人力以及时间;SSR位点会存在一些突变，比如起始位点的DNA会发生替代，插入和缺失导致非等位基因的出现[20];SSR多态性检测依赖PCR扩增效果，PCR扩增效果的好坏会受诸多因素影响，例如引物3`端的碱基发生突变会严重影响PCR的扩增效率[21]。为了避免这些问题的发生，研究者在实验过程中必须采取严格的实验手段以开发更加经济高效的SSR引物。

2 SSR的开发方法

目前，已经建立了多种SSR开发方法，包括构建基因组文库筛选法[22]、滤膜富集法[23]、磁珠富集法[24]、基于PCR技术开发SSR标记法[25]、数据库筛选法[26]以及基于高通量技术开发SSR标记[27]等方法。构建基因文库筛选法是通过提取、分离、纯化得到DNA片段，连接载体后转化到大肠杆菌中构建基因组文库，利用放射性同位素或其他发光化学物质标记的SSR探针与基因组文库中的DNA杂交，对阳性克隆结果进行测序并设计SSR引物[22]。此方法虽然工作量大，但是操作流程简单，是最经典的传统方法。滤膜富集法和磁珠富集法是基于基因文库筛选法的基础上开发的新方法，他们都是在构建基因文库之前利用SSR探针将基因组文库DNA片段进行富集，以此来提高阳性克隆的获得率。但是这两种方法依然需要构建基因组文库，操作过程较复杂。基于PCR技术开发的方法避免了构建基因文库，但是技术要求高，实验条件苛刻，实际应用较为困难。数据库筛选法就是利用核酸序列数据库查询已公布的SSR标记，同样避免基因组文库的构建，利用数据库获得SSR标记方便又快捷，但是筛选出的SSR标记多态性不如构建基因文库方法筛选出的SSR标记多态性好。高通量测序技术，即下一代测序技术，该技术可同时对数百万个DNA分子进行测序，其效率要远高于传统的Sanger测序法[28]。如岳华梅等[29]采用Illumina高通量测序技术，对兴国红鲤（Cyprinus carpio var.singuonensis）垂体和性腺等组织进行转录组测序分析，筛选出了多态性较好的9个SSR标记。这9个SSR位点可能与功能基因相关，从而可为后续遗传图谱构建、QTL定位等提供有力支持。上述的SSR标记开发方法各有自己的优势和不足，在研究中可根据自己的目的和状况来选择最适合自身的SSR标记的开发方法。

3 SSR在水产养殖方面的应用

3.1 种群的遗传多样性分析

遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和。但一般实验研究的是种内的遗传多样性，即种内个体之间或种群内不同个体的遗传变异总和。分析某一野生群体的遗传多样性，有助于对该种群种质资源的评估，对于以后作为经济动物引进和培养具有重要的指导意义。对于养殖群体的遗传多样性分析，能够对其种质资源进行分析，评价是否发生种质资源退化，从而通过引进优良原种等方式改善该养殖区域的养殖状况。遗传多样性是组成生物多样性的重要部分，SSR作为重要的分子标记，可用于检测个体基因型，统计群体的等位基因数目和频率，并利用分子遗传学和统计学原理，计算种群的遗传变异程度，初步评价种群的遗传多样性[30]。

近年来，SSR分子标记已经在多种水产动物的群体遗传多样性研究中发挥了重要作用。如慎佩晶等[31]对来自以色列、缅甸、孟加拉、核心种（南太湖2号）和泰国的5个罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）群体中的127个样品进行了遗传多样性分析，共检测出70个微卫星位点。并利用这些SSR作为分子标记，经统计和遗传分析得出这些群体的遗传相似数在0.367 4～0.796 5之间，平均遗传相似系数为0.554 1;亲缘关系最近的两群体为孟加拉群体和核心群体，其相似系数为0.796 5，而以色列和孟加拉这两个群体的相似系数为0.367 4，亲缘关系也最远。总体而言实验的所有种群的遗传多样性都比较高，为以后罗氏沼虾的杂交育种提供了理论依据。谭云飞等[32]运用微卫星标记技术对我国长江中下游流域的13個克氏原螯虾（Procambarus clarkii）野生群体进行了遗传多样性和遗传结构分析，对其等位基因数（Na）、期望杂合度（He）、观测杂合度（Ho）、多态性信息含量（PIC）、Hardy-Weinberg平衡指数与遗传距离等做了分析，结果发现克氏原螯虾在我国已初步形成3个不同的遗传群体，有向不同遗传群体分化的趋势，并建议要做好这3个种群的保种工作，防止发生种质退化。赵彦花等[33]对珠江口海域的黄唇鱼（Bahaba flavolabiata） 群体进行了遗传多样性分析，对黄唇鱼的微卫星位点进行扩增开发，通过毛细管电泳检测（Capillary electrophoresis，CE），并进行遗传分析计算得出黄唇鱼种群遗传多样性水平并没有随其种群数量的减少而下降，依然保持较高的水平，为以后的黄唇鱼遗传学研究提供了初步的分子基础。Du等[34]为了解日本对虾（Penaeus japonicus）种质资源现状，利用形态计量学分析和荧光微卫星标记对5个日本对虾群体的遗传多样性进行了分析。结果表明虽然这5个种群都具有较高的遗传多样性，但是地理距离越近的种群，其相似性越高。该结果意味着栖息地条件、环境条件和人类活动可能是造成日本对虾种群遗传变异的主要原因。通过遗传多样性分析可了解种群的遗传结构、生活状况和分析进化历程，才能提出合理的保护措施。综合上述研究实例可见，SSR作为理想的遗传标记，已广泛应用到水产动物遗传多样性研究中，推动了保种工作的进展。

3.2 数量性状的定位

数量性状的定位是指分析某一数量性状与染色体上某一DNA标记的关系，从而估计遗传效应[35]。因SSR具有极高的稳定性，使其成为能被利用进行数量性状定位的重要分子标记之一。对于数量性状的定位有助于优良性状的筛选，选择优势性状的个体或群体进行培养，能够提高养殖的经济效益，从而保护优秀的种质资源。近年来，越来越多的研究利用SSR作为分子标记对水产养殖物种进行了性状关联分析。袁文成等[36]采用高通量测序法，从翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）的转录组中筛选得到13对EST-SSR（Expression Sequence Target SSR）引物，对体长、体高、体厚及体重4种生长性状进行标记性状相关性研究，结果发现有5个微卫星标记与生长性状显著相关。该研究为翘嘴鳜的种质资源保护以及分子辅助标记育种提供分子机制上的依据。王丹等[37]通过对鲢（Hypophthalmichthys molitrix）的卵组织进行转录组测序分析，筛选出36个条多态性高的EST-SSR标记，其中两个位点（SCE26和SCE65）与生长性状显著相关。在全同胞家系中的统计分析发现，SCE26与鲢的体长和体重显著相关，而SCE65与鲢的肥满度显著相关。该研究为鲢的生长性状相关的基因鉴定提供帮助，为分子标记辅助育种提供基础的理论指导。由上述研究实例可以看出，SSR标记进行数量性状定位已经在水产养殖中发挥了重要作用。伴随着第二代测序技术的广泛应用和价格的持续走低，SSR标记的开发越发简单，以SSR为分子标记的生长性状相关的研究将在水产养殖中发挥越来越重要的作用。

3.3 DNA指纹图谱构建

Jefferys等[38]将人源小卫星DNA作为基因探针，与人体核DNA酶切片段杂交，得到由多个位点等位基因组成的长度不一的杂交带图纹，此图纹类似指纹，极少有两个人完全相同，所以称作DNA指纹（DNA fingerprint），多个DNA指纹组成DNA指纹图谱（DNA finger print）。DNA指纹图谱有多位点性、高变异性、遗传稳定的特点，可用于个体的鉴定、亲子关系鉴定以及检测目标基因组的变化。

鉴于DNA指纹图谱的上述优点，研究者们已将此项技术广泛应用于水产养殖中种质资源鉴定和物种区分，并取得了多项研究成果。廖梅杰等[39]采用指纹图谱技术对中国青岛、烟台，韩国浦项、群山、木浦，俄罗斯符拉迪沃斯托克的刺参（Apostichopus japonicus）群体进行了指纹图谱构建。其研究中筛选出的13个微卫星位点特异性较高，能够把8个实验群体一一区分开来，为以后刺参的种质资源鉴定提供了数据支撑。王成龙等[40]为了在草鱼（Ctenopharyngodon idellus）雌核发育后代的群体中区分出雌核发育草鱼以及团头鲂（Megalobrama amblycephala）和草鱼的杂交后代，构建了由14个SSR标记组成的3个草鱼群体的DNA指纹数据库构建DNA指纹图谱。此图谱可以简单、高效地区分出雌核发育的草鱼个体和草鲂杂交个体。我国是水产养殖大国，水产物种种群具有多样性，DNA指纹图谱的构建将会指导种群种质资源的鉴定和挖掘，进而促进水产养殖行业的发展。

3.4 遗传连锁图谱构建

遗传连锁图谱是指某一物种已知基因或遗传标记在染色体上的相对位置。遗传作图（Genetic mapping）即遗传图谱的构建，是利用遗传学原理和方法，构建能反映基因组中遗传标记之间遗传关系的图谱。SSR分子标记因其上述特点成为构建遗传连锁图谱的重要分子标记。因为遗传连锁图谱的制作有利于水产动物功能基因和优良性状的深入研究，众多的研究利用SSR标记在多个水产物种中构建了遗传连锁图谱，并在水产养殖中进行了广泛的应用。

趙永伟等[41]以半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）的全同胞家系为作图群体，构建了其雌、雄的SSR标记遗传连锁图谱。他们构建的连锁图的覆盖率各为83.3%和82%，其质量已达中等水平，可一定程度上指导半滑舌鳎的遗传育种工作。庞仁谊等[42]通过SSR标记对牙鲆（Paralichthysolivaceus）遗传连锁图谱的构建，相比于宋文涛等[43]国内构建的牙鲆第一张遗传连锁图谱有更高的覆盖率，且标记数也有所增加，使得图谱的质量、可信度和实际使用价值都得到了相应的提高，该图谱进一步推动了牙鲆的遗传育种工作。Guo等[44]利用SSR标记构建了鲢（Hypophthalmichehys molitrix）的第二代遗传连锁图谱，该遗传连锁图谱覆盖率明显提升，达到了93.1%，为鲢的数量性状基因的定位、比较基因组学和标记辅助选择等研究提供了遗传学基础。

4 结语

水产养殖业是我国重要的支柱产业，水产养殖业的健康、优质、可持续发展离不开现代科学技术的支持。分子标记辅助育种作为重要的科学育种手段，已经广泛应用到水产养殖行业中。SSR标记技术因为其自身的优势，能够对养殖群体进行遗传多样性分析，为保护种质资源提供重要的指导;对数量性状进行定位和分析，筛选出具有生长优势的基因型，提高水产养殖的经济效益;制作覆盖率高的遗传连锁图谱，为以后的育种和养殖提供遗传学基础;制作DNA指纹图谱，能够在混养的大型养殖环境中，避免近亲交配所带来的种质退化、生长个体变小、生长优势消失等现象。随着生物信息技术和分子生物学的不断发展，SSR标记的开发和利用将会不断深入，使其在水产养殖领域具有广阔的应用前景。

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Abstract：In order to understand the application of simple sequence repeats （SSR） molecular markers in aquaculture and to develop marker-assisted breeding for aquaculture animals in the future， the research progress of the development methods of SSR， genetic diversity analysis in breed population， quantitative trait mapping， DNA fingerprinting and genetic linkage map construction by using SSR were reviewed. SSR molecular markers have broad application prospects in germplasm identification， genetic distance analysis and molecular marker-assisted breeding of aquaculture animals.

Key words：SSR; molecular markers; aquaculture

（收稿日期：2021-07-13）