黄达 刘燕 黄兰松 岑团 刘文静 潘兴寿 黄照河

【摘要】 目的  建立小鼠心肌細胞缺氧/复氧模型，观察α-1抗胰蛋白酶（α-1 antitrypsin，A1AT）对小鼠心肌细胞凋亡的影响。

方法  体外采用连二亚硫酸钠（Na2S2O4）4 mmol/L诱导的缺氧培养基培养小鼠心肌细胞，模拟缺氧/复氧模型，并筛选A1AT最佳干预浓度，筛选A1AT最佳干预浓度实验分为7个组：Blank组、Control组、H/R组、A1AT 10 μmol/L 组、A1AT 20 μmol/L 组、A1AT 40 μmol/L 组以及A1AT 80 μmol/L 组。筛选最佳干预时间实验分为8个组：Blank组、Control组、H/R组、A1AT 1 h组、A1AT 2 h组、A1AT 4 h组、A1AT 6 h组及A1AT 12 h组。之后A1AT干预实验分组：正常组（Control组）、缺氧/复氧组（H/R组）、α-1抗胰蛋白酶干预组（A1AT组）。利用CCK-8检测细胞功能、流式细胞仪检测细胞凋亡、免疫荧光及Western Blot 检测caspase-3的表达。并用SPSS 22.0进行数据统计。

结果  A1AT最佳干预浓度为20 μmol/L，最佳干预时间为4小时。流式细胞仪检测发现H/R组细胞凋亡率增加，A1AT组细胞凋亡率明显下降，Control组、H/R组及A1AT组三组比较差异有统计学意义（ P <0.05）。免疫荧光检测发现H/R组caspase-3分子表达强阳性，与Control组及A1AT组比较，差异有统计学意义（ P <0.05）。Western Blot检测发现H/R组caspase-3蛋白表达上调，与Control组及A1AT组比较，差异有统计学意义（ P <0.05）。

结论  α-1抗胰蛋白酶对小鼠缺氧/复氧心肌细胞凋亡具有改善作用。

【关键词】  α-1抗胰蛋白酶;Na2S2O4;缺氧/复氧;凋亡;caspase-3

中图分类号： R363    文献标志码： A    DOI： 10.3969/j.issn.1003-1383.2021.08.003

Effects of α-1 antitrypsin on cardiomyocyte apoptosis in hypoxia/reoxygenation mice

HUANG Da， LIU Yan， HUANG Lansong， CEN Tuan， LIU Wenjing， PAN Xingshou， HUANG Zhaohe▲

（Department of Cardiovascular， Affiliated Hospital of  Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective  To establish a hypoxia/reoxygenation model of  cardiomyocytes in mice， and observe the effect of α-1 antitrypsin （A1AT） on cardiomyocyte apoptosis in mice.

Methods  Mouse cardiomyocytes were cultured in vitro by hypoxia medium induced by （Na2S2O4） 4 mmol/L of sodium dithionite， hypoxia/reoxygenation model was simulated， and the best intervention concentration of A1AT was selected. The experiment of screening the best intervention concentration of A1AT was divided into 7 groups： blank group， control group， H/R group and A1AT 10 μmol/L group， A1AT 20 μmol/L group， A1AT 40 μmol/L group and A1AT 80 μmol/L group. The experiment of screening the best intervention time was divided into 8 groups： blank group， control group， H/R group， A1AT 1 h group， A1AT 2 h group， A1AT 4 h group， A1AT 6 h group and A1AT 12 h group. After that， A1AT intervention experiment was divided into normal group （control group）， hypoxia reoxygenation group （H/R group） and α-1 antitrypsin intervention group （A1AT group）. CCK-8 was used to detect cell function， flow cytometry was used to detect the expression of apoptosis， and immunofluorescence and Western Blot were used to detect the expression of caspase-3. In addition， SPSS 22.0 was used for data statistics.

Results  The best intervention concentration for A1AT was 20 μmol/L， and the best intervention time was 4 hours. The results of flow cytometry showed that the apoptosis rate increased in the H/R group and decreased significantly in the A1AT group， and there was statistically significant difference among the control group， the H/R group and the A1AT group （ P  < 0.05）. The Immunofluorescence detection revealed that the expression of caspase-3 molecules in the H/R group was strong positive， and compared with the control group and the A1AT group， the difference was statistically significant （ P  < 0.05）. Western Blot detection revealed that the expression of caspase-3 molecules in the H/R group was up-regulated， and compared with the control group and the A1AT group， the difference was statistically significant （ P  < 0.05）.

Conclusion  α-1 antitrypsin can improve the apoptosis of hypoxia/reoxygenation cardiomyocytes in mice.

【Key words】  A1AT; Na2S2O4; hypoxia/reoxygenation; apoptosis; caspase-3

目前，心血管病死亡占城鄉居民总死亡原因的首位，农村占45.91%，城市占43.56%[1]。《中国心血管健康与疾病报告2019》推算心血管病现患人数3.30亿，其中冠心病1100万，肺源性心脏病500万，心力衰竭890万，先天性心脏病200万，高血压2.45亿。心血管病死亡率的上升趋势主要是由于缺血性心脏病（ischemia heart disease，IHD）死亡上升所致。急性心肌梗死是IHD的主要类型，早期再灌注治疗是恢复心肌血液供应唯一有效的途径，虽然及时恢复心肌血液灌注挽救了不少生命，但心脏血液供应不足一段时间后，恢复血液灌注心肌损伤反而加重，从而出现心肌顿抑、心脏功能下降甚至致命性心律失常，即心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI）。再灌注后心肌坏死面积增加50%[2]。但MIRI的发生机制尚未完全明了，可能与氧自由基、炎性细胞因子、蛋白酶等介导的内皮细胞功能受损及心肌受损有关[3～4]。其中，凋亡在MIRI中起到很关键的作用。然而，迄今为止，尚未发现任何一种有效防止MIRI的方法。α-1抗胰蛋白酶（α-1 antitrypsin，A1AT）是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一员，其主要作用是保护机体正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤，抑制感染和炎症，维持机体内环境的平衡[5]。近年来，A1AT在干预炎症因子的治疗研究中愈来愈得到广大学者的青睐，目前已经广泛用于各种炎症疾病的治疗。本实验研究是在心肌缺血再灌注损伤学说的基础上，总结前人经验，建立小鼠心肌细胞缺氧/复氧模型，探索A1AT对小鼠缺氧/复氧心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

导师组冻存小鼠心肌细胞（型号FMC84，来源：ATCC），caspase-3抗体购自CST。

1.2 检测方法

1.2.1 CCK-8检测法筛选A1AT最佳干预浓度及最佳干预时间

筛选A1AT最佳干预浓度实验分为 7个组：Blank组、Control组、H/R组、A1AT 10  μmol/L 组、A1AT 20 μmol/L 组、A1AT 40 μmol/L 组以及A1AT 80 μmol/L 组，按设定的浓度预先干预2小时，孔中换成4 mmol/L的Na2S2O4诱导缺氧1小时后，吸取Na2S2O4溶液弃掉，并予PBS清洗两次，予含有10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L及80 μmol/L的α-1抗胰蛋白酶的完全培养基复氧24小时，用CCK8检测它们的活力，筛选最佳α-1抗胰蛋白酶干预浓度。筛查A1AT最佳干预时间实验分为8个组：Blank组、Control组、H/R组、A1AT 1 h组、A1AT 2 h组、A1AT 4 h组、A1AT 6 h组及A1AT 12 h组，心肌细胞接种至96孔板中，以α-1抗胰蛋白酶最佳干预浓度干预，待细胞贴壁后，予20 μmol/L α-1抗胰蛋白酶分别干预1 h、2 h、4 h、6 h和12 h，到时间即去掉α-1抗胰蛋白酶药液，并予PBS清洗两次，予4 mmol/L Na2S2O4干预60 min建立小鼠心肌细胞缺氧模型，之后去掉Na2S2O4溶液，予完全培养基复氧24小时，进行CCK8检测。

1.2.2 利用流式细胞仪双染法检测细胞凋亡

我们利用流式细胞仪检测细胞凋亡，采用AnnexinV-FITC/PI双染法标记小鼠心肌细胞FMC84，对Control组、H/R组、A1AT组进行凋亡检测，收集细胞后在1小时内完成上机检测。设置四个象限，分别为1象限：此区域为机械损伤及坏死细胞;2象限：此区域为晚期凋亡细胞;3象限：此区域为存活细胞;4象限：其区域为早期凋亡细胞。以4象限细胞数来判定各组细胞早期凋亡程度。

1.2.3 利用免疫荧光检测caspase-3表达

按一定细胞浓度在24孔板种植细胞，待细胞爬片后以4%的聚甲醛固定，0.5% Triton 破膜，山羊血清封闭，之后以一抗4℃ 孵育过夜，加荧光二抗，滴加DAPI再染核，在荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.4 Western Blot检测caspase-3表达

按一定的细胞浓度在6孔板中種植细胞，待细胞贴壁后进行造模及药物干预，收取细胞，提取蛋白，按提取的蛋白浓度在电泳槽中上样，跑电泳，转膜，一抗孵育过夜，孵育二抗，利用凝胶系统成像仪进行显影。

1.3 统计学方法

用Graphprism 5.0进行作图。应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（  ±s ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 q 检验（Newman-Keuls法），检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结  果

2.1 A1AT干预心肌细胞缺氧/复氧的浓度梯度探索

与Blank组比较，不同浓度的A1AT均可不同程度地影响小鼠心肌细胞活力，其中A1AT 20 μmol/L 组的影响最明显。提示α-1抗胰蛋白酶20 μmol/L是最佳干预浓度。见表1。

2.2 A1AT干预心肌细胞缺氧/复氧的时间梯度探索

与Control组相比，α-1抗胰蛋白酶作用时间不同可对细胞活力造成不同的影响，其中A1AT 4 h组作用时间最佳，4小时后随着α-1抗胰蛋白酶作用时间越长，细胞活力逐渐下降。α-1抗胰蛋白酶4小时作用的OD值与对照组及A1AT 2 h组比较无统计学意义，但与其他作用时间组及H/R组比较差异均有统计学意义（ P <0.05）。提示α-1抗胰蛋白酶干预的最佳时间为4小时。见表2。

2.3 流式细胞仪检测小鼠心肌细胞凋亡

与Control组比较，H/R组心肌细胞早期凋亡明显增加，A1AT干预后心肌细胞凋亡减少，差异有统计学意义（ P <0.05）。结果提示Na2S2O4诱导的心肌细胞缺氧/复氧可以增加心肌细胞凋亡，A1AT预先干预后Na2S2O4诱导的心肌细胞缺氧/复氧心肌细胞早期凋亡减少（图1）。

2.4 免疫荧光检测小鼠心肌细胞caspase-3分子表达

caspase-3免疫荧光阳性为小鼠心肌细胞核呈现蓝色荧光物质。Control组、H/R组、A1AT组caspase-3的平均阳性表达率分别为19.16%，68.47%，35.52%，染色强度为弱阳性、强阳性、弱阳性，平均总积分分别为1分，5分，2.67分。Control组染色为阴性，H/R组及A1AT染色为阳性，且H/R组较A1AT组更为明显（图2），三组比较差异有统计学意义（ P <0.05）。提示A1AT对MIRI细胞凋亡有保护作用。

2.5 Western Blot 检测小鼠心肌细胞 caspase-3蛋白表达

我们利用Western Blot 技术对caspase-3蛋白的表达水平进行检测，结果发现：与Control组比较，H/R组caspase-3表达明显上调，A1AT干预后其表达明显下调，三组比较差异有统计学意义（ P <005）（图3）。说明A1AT对MIRI心肌细胞凋亡具有保护作用。

3 讨  论

MIRI后坏死心肌的面积增加了50%[2]，但发生机制尚未完全明了，可能与氧化应激、炎症因子等介导的细胞凋亡有关[3～4]。由于MIRI预后差，危害大，对MIRI的治疗也成为当前医疗界的研究热点之一。

A1AT是急性反应性蛋白质，在炎症性疾患时，A1AT可透过毛细血管进入组织液，在炎症局部往往浓度很高，对急性炎性疾病有一定限制作用[6]。A1AT具有免疫调节、抗炎和细胞保护特性，与降低IL-6和IL-8的表达和成熟有关[7]。冠状动脉硬化症的发生与炎症因子密切相关，国外研究发现，血浆A1AT水平与心绞痛患者冠状动脉狭窄的存在和严重程度相关[8]，还有研究发现，A1AT可以抑制IL-1的产生从而影响急性冠脉综合征的预后[9]。A1AT在干预炎症因子的治疗中愈来愈得到广大学者的青睐，目前已经广泛用于各种炎症疾病。因此，干预炎症因子对防治MIRI尤为重要。

缺血性心肌病大多数是由急性冠脉综合征演变而来，且其发生机制与氧自由基、炎症因子有关[10]。氧化应激是炎症的特征之一， 氧化应激不仅可以导致组织损伤， 还可以促进炎症反应[11]。氧化应激是炎症反应的特征表现之一，氧化应激导致的炎症反应在缺血再灌注损伤发生时爆发[12～13]。因此，阻断炎症反应及氧化应激可以在一定程度上减轻缺血再灌注损伤。炎症细胞因子的代表性家族为白介素家族，处于免疫反应及凋亡的上游，可以调控凋亡的发生，从而加剧缺血再灌注损伤[14]。我们的研究发现，心肌细胞缺氧/复氧后，细胞凋亡发生率明显减少，caspase-3表达明显增加，提示凋亡参与心肌缺血再灌注损伤的发生发展，这与王娓娓团队及李奇的研究一致[15～16]。近年来，随着临床药物的深入研究与应用发现，A1AT在控制炎症和免疫过程中起关键作用[17～18]，我们的研究亦发现，心肌细胞缺氧/复氧予A1AT干预后，心肌细胞凋亡发生率明显下降，且caspase-3表达明显下降，这可能与A1AT可以有效干预炎症反应[19]进而抑制细胞凋亡有关。说明A1AT具有干预凋亡的作用，但目前这方面的研究甚少。但有国外报道A1AT可减少缺血再灌注引起的急性炎症损伤[20]，有学者使用内皮细胞单层暴露于缺氧/复氧模型来研究A1AT在人脐静脉内皮细胞中的作用，结果发现 A1AT的过表达可抗氧化应激从而降低了细胞凋亡并促进了增殖[21]。

综上所述，凋亡是MIRI的关键环节，A1AT可以下调caspase-3，A1AT可能通过干预凋亡起到预防心肌缺血再灌注损伤的作用。

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（收稿日期：2021-04-13 修回日期：2021-07-23）

（編辑：梁明佩）