王黎霞，张 鹏，张建军，安 健*

(1.北京农业职业学院牧医系，北京 102442；2.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

球虫病是艾美耳属球虫感染所引起的原虫病[1]。疫苗是鸡球虫病主要的防控手段。其中，基因工程疫苗以独特的优势具有广阔的应用前景[2]，保护性抗原在球虫病重组疫苗的研制中起着十分重要的作用，寻找合适的抗原是未来球虫免疫的重要选择[3]。柔嫩艾美耳球虫微线蛋白4(Eimeriatenellamicroneme protein 4，EtMIC4)是一种新发现的艾美耳球虫蛋白，分子量240 kD，具有重复的TSP-1和EGF结构域，在球虫入侵宿主细胞的过程中起到重要的作用。JAVIER等[4]用5’RACE的方法首次克隆到EtMIC4基因的全长序列。黄欣梅等[5]和DU等[6]利用大肠杆菌表达EtMIC4蛋白的C端，此重组蛋白免疫试验鸡，能够部分抵抗柔嫩艾美耳球虫的攻虫的致病性，然而真核表达的蛋白在表达后修饰方面优于原核表达产物，更接近原来蛋白的结构。本研究是为了获得重组柔嫩艾美耳球虫微线N端蛋白(RecombinantEimeriatenellamicroneme protein 4 N，rEtMIC4N)，所以克隆EtMIC4N基因，与已发表的基因序列比较，构建真核表达载体pPICZαA/EtMIC4N，利用毕赤酵母(Pichiapastoris)表达rEtMIC4N，为后续其免疫原性研究打基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，北京农学院病理实验室保存。

pGEM-T克隆载体、表达载体pPICZαA、大肠杆菌JM109、毕赤酵母GS115、Trizol为Invitrogen公司产品，M-MLV反转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Oligo(dT)15、Rnasin、DNA胶回收试剂盒为TaKaRa产品。

1.2 方 法

1.2.1 EtMIC4N特异性片段的克隆和序列分析 Trizol一步法从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊分离总RNA，根据Genebank设计柔嫩艾美耳球虫微线蛋白4基因N端(EtMIC4N)引物[7]，进行RT-PCR扩增、克隆、测序和序列分析。

1.2.2 重……