马梅燕，冀慎英，张湘豫，卢梦云，邹先琼

（1. 桂林医学院附属口腔医院，桂林 541004； 2. 桂林医学院 a. 生物技术学院；b. 基础医学院，桂林 541100）

人类糖脂转运蛋白（glycolipid transfer protein，GLTP）的空间结构是由α-螺旋组成的特别的两层“三明治”状结构，这种“三明治”状结构被认为是真核生物GLTP蛋白家族的结构基础及原型蛋白［1］。GLTP位于人类12号染色体（基因座12q24.11）上，编码一个可溶的约24 kD的糖脂转运蛋白，介导糖鞘脂（glycosphingolipid，GSL）膜间转运并调节细胞内GSL的稳态水平［2］。GLTP被认为在葡萄糖神经酰胺代谢中发挥作用，其过表达会导致细胞内葡萄糖神经酰胺的合成和转移显著增加［3］。然而，决定特定糖鞘脂蛋白选择性的机制以及GLTP如何结合到目的膜和最终释放到受体膜的过程仍不清楚［4-5］。特异性蛋白1（specificity protein 1，Sp1）及特异性蛋白3（specificity protein 3，Sp3）能调控GLTP的表达，而神经酰胺处理改变了Sp1及Sp3与GLTP启动子结合的亲和性，降低了Sp3的乙酰化水平［6］。迄今为止，人类GLTP在肿瘤发生发展中的作用及其表观遗传调控机制的研究尚未见于文献。

表观遗传调控涉及DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA（miRNA）的作用等，与炎症、癌症、神经系统疾病、心血管疾病和自身免疫疾病等的发生发展密切相关。DNA甲基化是一种重要的表观遗传调控机制，哺乳动物的DNA甲基化主要发生在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷（cytosine-guanine dinucleotide，CpG）中［7］。在组蛋白修饰中，组蛋白H3K4Me1的分布可预测转录的状态和启动子的激活，在与关键染色质调控因子的结合中起重要作用［8-9］。组蛋白H3K4Me3存在于真核生物基因组启动子区域，通常被认为是一种激活的调控方式，可介导基因的转录激活，在基因转录中具有指示作用［10］。在人红白血病细胞系K562细胞中，MYB的启动子区域有激活型的组蛋白H3K27Ac、H3K4Me1的修饰，血红素诱导分化后，这些表观修饰的富集度降低［11］。组蛋白H3K27Ac常位于基因的增强子中，在基因转录中为激活状态［12］。其在食管癌放射抵抗细胞中高表达，且富集于OIP5-AS1的启动子区域［13］。miRNA是内源性合成的约22～25个核苷酸的小的非编码RNA分子，能通过控制靶mRNA的稳定性和翻译参与调控关键的生物学过程，如细胞增殖、凋亡、分化和血管生成等［14］。

本研究的目的在于通过生物信息学分析研究人类GLTP在肿瘤发生发展中的作用及其表观遗传调控机制，为进一步深入阐明人类GLTP的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 人类GLTP序列的获得

利用美国国家生物技术信息中心NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索人类GLTP，获得其基因序列号、核酸序列号以及蛋白序列号，并进一步的分析。

1.2 肿瘤组织中的表达及生存分析

通过GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）分析人类GLTP在胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）肿瘤组织及其癌旁正常组织中的表达情况［15］，并从GEPIA数据库的子程序“stage plot”中下载PAAD患者的GLTP表达水平的病理分期图，从而分析GLTP表达水平与PAAD患者病理分期的关系。

1.3 甲基化对GLTP的作用

通过在线服务器cBioportal（https://www.cbioportal.org/）分析人类GLTP在PAAD组织中的甲基化与基因表达的相关性［16］。通过Wanderer在线服务器（http://maplab.imppc.org/wanderer/）分析PAAD组织及癌旁正常组织人类GLTP甲基化程度的差异［17］。

1.4 组蛋白修饰对GLTP的作用

通过在线服务器UCSC Genome Browser（http://www.genome.ucsc.edu/）分析组蛋白修饰对GLTP的调控作用［18］。

1.5 ceRNA调控网络的构建

通过miRcode在线分析工具（http://mircode.org/）预测可能调控人类GLTP的miRNA种类［19］，并利用DIANA Tools数据库（http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=site/page&view=software）的子程序MirPath v.3及HMDD数据库（http://www.cuilab.cn/hmdd?Tdsourcetag=s_pcq q_aiomsg）对这些潜在的miRNA影响的信号通路及经过试验验证的相关疾病进行分析。通过DIANA Tools数据库的子程序LncBase v.2进一步分析得到经过试验验证的、与这些潜在作用的miRNA有相互作用且得分较高的lncRNA（阈值为0.539）［20］。通过Cytoscape 3.8.0软件绘制人类GLTP内源竞争RNA（ceRNA）调控网络［21］。

2 结果与分析

2.1 人类GLTP序列的获得

利用美国国家生物技术信息中心NCBI检索人类GLTP，获得其基因序列号为NC_000012.1，核酸序列号为NM_016433.4，蛋白序列号为NP_057517.1。

2.2 肿瘤组织中的表达及生存分析

通过GEPIA数据库分析人类GLTP在多种肿瘤组织及其癌旁正常组织中的表达情况，结果表明，人类GLTP在PAAD组织中的表达水平高于癌旁正常组织，差异显著（P＜0.05）（图1a）。这提示GLTP可能参与了PAAD的发生发展。

对GLTP表达水平与PAAD患者病理分期的相关数据进行分析，结果显示，GLTP表达水平在PAAD患者不同病理分期中的表达差异不显著（P＞0.05），单因素方差分析得出F值为1.36，其对应P值为0.256（图1b）。

图1 人类GLTP在PAAD发生发展中的作用分析Fig. 1 Analysis of role of human GLTP in initiation and progression of PAAD（a）人类GLTP在PAAD组织及其癌旁正常组织中的表达（该图通过GEPIA数据库在线分析获得。图中红色箱点图表示人类GLTP在PAAD组织中的表达水平，灰色箱点图表示人类GLTP在癌旁正常组织中的表达水平，*P＜0.05。T：肿瘤组织；N：癌旁正常组织）；（b）人类GLTP表达水平与PAAD患者病理分期图（由GEPIA数据库中“stage plot”分析获得）。(a) Expression of human GLTP in PAAD tissues and its adjacent normal tissues (The figure was obtained through online analysis of GEPIA database. The red box dot plot shows the expression level of human GLTP in PAAD tissues, and the gray box dot plot shows the expression level of human GLTP in adjacent normal tissues. *P＜0.05. T: Tumor tissues; N: Adjacent normal tissues); (b) Human GLTP expression level and pathological staging in PAAD patients (Obtained by “stage plot” analysis in GEPIA database).

2.3 甲基化对人类GLTP的调控作用

通过在线服务器cBioportal对人类GLTP在PAAD组织中的甲基化与基因关系进行分析，结果显示，在178个PAAD病人样本中Spearman（P=1.439e-4）和Pearson（P=7.002e-4）相关系数的P值均小于0.05（图2a），表明在PAAD细胞中，人类GLTP的甲基化与其表达水平呈现显著的负相关性。Wanderer在线服务器分析结果也表明，人类GLTP上游大约500 bp范围内至少有两个CpG位点在PAAD组织及癌旁正常组织甲基化程度存在显著差异（图2b）。

图2 人类GLTP甲基化与PAAD的相关性分析Fig. 2 Correlation analysis of methylation of human GLTP and PAAD（a）PAAD组织中人类GLTP甲基化与基因表达的相关性分析；（b）PAAD及癌旁组织中人类GLTP甲基化程度的比较分析。箭头显示 GLTP的位置及转录方向。CNA: 拷贝数畸变。(a) Correlation analysis of methylation of human GLTP and gene expression in PAAD tissues; (b) Comparative analysis of GLTP methylation in pancreatic cancer and adjacent tissues. The arrow shows position and transcription direction of human GLTP. CNA: Copy number alterations.

2.4 组蛋白修饰对GLTP的作用

通过在线服务器UCSC Genome Browser分析组蛋白修饰对GLTP的作用，结果表明：在K562细胞中，组蛋白H3K4Me1在GLTP的第一外显子上下游结合水平显著上升，提示组蛋白H3K4Me1可通过上调GLTP的表达进而影响肿瘤发生发展的进程；组蛋白H3K4Me3在K562细胞内和H1-hsc细胞中的结合水平相似；在K562细胞中组蛋白H3K27Ac在第一外显子上下游中的结合水平显著上升，这提示组蛋白H3K27Ac可通过上调GLTP的表达进而影响肿瘤发生发展的进程（图3）。

图3 组蛋白H3K4Me1、H3K4Me3及H3K27Ac对人类GLTP的调控作用分析Fig. 3 Histone H3K4Me1, H3K4Me3 and H3K27Ac analysis of human GLTP regulation effect（a）人类GLTP的结构；（b）人类GLTP在对应区域与组蛋白H3K4Me1、组蛋白H3K4Me3、组蛋白H3K27Ac的结合程度。 (a) Genomic structure of human GLTP; (b) The binding degree of human GLTP to histone H3K4Me1, histone H3K4Me3 and histone H3K27Ac in the corresponding region.

2.5 ceRNA调控网络的构建

通过miRcode在线分析工具预测可能调控人类GLTP的miRNA种类，结果表明，灵长类保守性为56%及以上的miRNA主要包括hsa-miR-27a-3p、hsamiR-125a-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-129-5p、hsamiR-372-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-141-3p、hsamiR-125a-3p、hsa-miR-138-5p等（表1）。

表1 通过miRcode分析调控人类GLTP表达的miRNATab. 1 miRNA analysis for regulating human GLTP expression through miRcode

利用DIANA Tools数据库的子程序MirPath v.3及HMDD数据库对这些潜在miRNA影响的信号通路及经过试验验证的相关疾病进行分析，结果表明，这些与人类GLTP潜在作用的miRNA与多种肿瘤及信号通路存在较强的关联性。MirPath v3.0及HMDD检索表明：hsa-miR-27a表达上调抑制乳腺癌、肝癌、胰腺癌等的发生发展［22］；hsa-miR-125a表达上调促进心力衰竭、狼疮性肾炎、肌萎缩，而抑制黑色素瘤、白血病等的发生发展［23］；hsa-miR-129表达上调抑制前列腺癌的发生发展［24］；hsa-miR-125b表达上调促进前列腺癌、阿尔茨海默病、乙型肝炎病毒感染、口腔鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤等的发生发展［25］；hsa-miR-372表达上调促进睾丸肿瘤、小脑癌、结直肠癌、乳腺癌等的发生发展［26］；hsamiR-141表达上调抑制肾细胞癌的发生发展，其在前列腺癌组织中表达下调［27］；hsa-miR-138表达上调促进肺癌的发生发展，而抑制胆囊癌、心血管疾病、肾细胞癌等的发生发展［28］。

图4 人类GLTP的ceRNA调控网络分析Fig. 4 ceRNA regulatory network of human GLTP将miRcode预测得到的miRNA以及DIANA Tools-LncBase v.2分析得到的lncRNA输入Cytoscape软件进行构建获得人类GLTP的ceRNA调控网络。浅蓝色矩形表示lncRNA，蓝紫色V形表示miRNA，红色棱形表示GLTP。The ceRNA regulatory network of human GLTP was constructed by inputting the miRNA predicted by miRcode and the lncRNA analyzed by DIANA Tools-lncBase V. 2 into Cytoscape software. The light blue rectangle represents lncRNA, the blue-purple V-shape represents miRNA, and the red prismatic represents GLTP.

3 讨论

胰腺癌是临床上常见的消化系统肿瘤，其特点是恶性程度高、发现较晚且进展迅速，其主要的病理类型为PAAD［29］。在肿瘤组织中的表达及生存分析结果中，人类GLTP在PAAD组织中的表达水平高于癌旁正常组织，提示GLTP很可能参与了PAAD的发生发展。值得注意的是，GLTP表达水平与PAAD临床分期差异不显著，这提示PAAD的发生发展可能受到包括GLTP在内的多种基因的影响，同时还很有可能受其他拮抗因子的影响，但具体原因还有待研究并加以验证。

甲基化分析结果表明，在PAAD细胞中，人类GLTP的甲基化程度与其表达水平呈显著的负相关性。而相对于癌旁组织，人类GLTP在PAAD细胞中呈高表达。这些结果提示，在PAAD细胞中，人类GLTP低度的甲基化可能上调了GLTP的表达，进而发挥了促进PAAD发生发展的作用。组蛋白修饰的分析结果表明，组蛋白H3K4Me1和组蛋白H3K27Ac很有可能通过上调人类GLTP的表达进而促进肿瘤的发生和发展。miRNA通过靶向参与细胞增殖、生存、凋亡和转移相关基因起到抑癌基因或癌基因的作用［30］。将人类GLTP在线分析数据直接输入到Cytoscape这个可视化的通用平台，生成图形化的网络图，直观地展示出了人类GLTP的ceRNA调控网络。该调控网络中重要的miRNA、lncRNA的功能及其在疾病中的关系提示了人类GLTP的相关研究方向。

本研究利用了近几年发展的生物信息学在线网络分析工具，证明了人类GLTP在PAAD发生发展中可能发挥了重要的作用，并揭示了其可能的表观遗传调控机制，为深入研究人类GLTP在肿瘤发生发展中的作用及其分子调控机制提供了参考。