张阳洋，范金波，麻 奥，周素珍，吕长鑫

（渤海大学食品科学与工程学院 辽宁省食品安全重点实验室生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州 121013）

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）是一种包含583 个氨基酸残基的心形单体球蛋白，由3 个同源结构域构成（I～III），每个结构域包含2 个亚结构域（如IA 和IB）[6]。2 个重要结合位点分别位于亚结构域IIA 和IIIA 的疏水腔中，即结合位点Sudlow’s sites I 和II[7]。BSA 可与活性成分形成复合物，增加其溶解度、稳定性、生物利用度，从而提高其作用效率[8]。BSA 能够结合多种化合物，包括药物、脂肪酸、类固醇、染料、金属、维生素、多酚和类胡萝卜素[6，9-10]。

槲皮素（Quercetin，QUE）属于黄酮醇类，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等生物活性，水溶性差限制了其应用[11]。槲皮素与BSA 结合常数为7.60×105～8.38×106L/mol，结合位点为Sudlow’s sites I[12]。Precupas 等[13]研究表明中性形式槲皮素以非平面构象与Sudlow’s sites I 结合，降低了BSA 热稳定性，而阴离子形式槲皮素以平面构象的形式结合到蛋白亚结构域IIA Sudlow’s sites II 位点上，增加了蛋白质相应结构域的热稳定性。白藜芦醇（Resveratrol，RES）是两性物质，与BSA 结合常数为2.52×104～1.60×105L/mol，主要结合位点位于结构域I[14-15]。咖啡酸β-苯乙醇酯（Caffeic acid phenethyl ester，CAPE）是天然蜂胶的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等生物活性，CAPE与HSA 的结合常数为8.88×105～2.76×106L/mol，结合位点为Sudlow’s sites I[16]。

目前大部分研究集中在单一活性成分与BSA相互作用，然而同时结合多种活性成分提供多种健康作用的功能食品越来越受到市场的青睐。因此以BSA 为载体，研究BSA 同时装载多种活性成分的意义重大，目前相关的研究还非常有限[17]。本文以BSA 为模型蛋白，以QUE、RES 和CAPE 为配体分子，通过荧光光谱结合分子模拟技术研究BSA-多配体复合物形成机理及多酚保护作用，为以BSA 为基础的多种活性成分共装载的蛋白载体的制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

QUE（98%）、RES（反式，98%）、CAPE（98%）、布洛芬 （Ibuprofen，IBU，98%）、华法林（Warfarin，WARF，98%），生工生物工程（上海）有限公司；牛血清白蛋白（99%），北京百灵威科技有限公司；无水乙醇、浓盐酸等均为分析纯级，天津市风船化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

F-7000 荧光分光光度计，日本日立高新技术公司；FE20 实验室PH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-2700 紫外-可见光分光光度计，日本SHIMADZU 公司；WD-9403C 紫外仪（波长为365 nm 的紫外灯，功率为28 W），北京六一仪器厂；Milli-Q Reference 型超纯水机，德国默克密理博有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 储备液的配制 配制0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），并以此为溶剂配制1.2×10-4mol/L BSA 储备液，以及浓度为7.2×10-4mol/L QUE、RES 和CAPE 储备液。

1.3.2 多酚与BSA 相互作用的荧光光谱 准确移取2 mL Tris-HCl 缓冲液和30 μL 1.2×10-4mol/L BSA 标准溶液于3.5 mL 石英比色皿中，再加入一定量的7.2×10-4mol/L QUE（RES/CAPE）溶液，添加缓冲液至3 mL。待反应15 min 后以波长280 nm 为激发波长，激发和发射狭缝设定为2.5 nm 和5 nm，分别在298 K 和310 K 下测定波长290～450 nm 的荧光光谱并记录。

在校门口问过门卫，学校建筑除了翻新了表面之外基本内部结构没有改动。而门卫说还没看到马老师下班，应该要么在教室要么在办公室。我正准备走向教学楼时，门卫喊住我，叫我把伞放在门口就行。

1.3.3 多酚与BSA 结合位点分析 准确移取2 mL Tris-HCl 缓冲液和30 μL 1.2×10-4mol/L BSA标准溶液于3.5 mL 石英比色皿中，再加入25 μL 7.2×10-4mol/L IBU 溶液，充分摇匀反应15 min 后加入一定量的7.2×10-4mol/L QUE（RES/CAPE）溶液，添加缓冲液至3 mL，摇匀后反应15 min。以波长280 nm 为激发波长，激发和发射狭缝设定为2.5 nm 和5 nm，在298 K 下测定290～450 nm 的荧光光谱并记录。将标记物换成WARF 重复上述步骤。

1.3.4 添加顺序对多酚与BSA 结合的影响 准确移取2 mL Tris-HCl 缓冲液和30 μL 1.2×10-4mol/L BSA 标准溶液于3.5 mL 石英比色皿中，再加入20 μL 7.2×10-4mol/L QUE 溶液，摇匀反应15 min 后加入一定量的7.2×10-4mol/L RES 溶液，添加缓冲液至3 mL。待反应15 min 后以波长280 nm 为激发波长，激发和发射狭缝设定为2.5 nm和5 nm，在298 K 下测定波长290～450 nm 的荧光光谱并记录，3 种多酚两两互作共进行6 组试验。

1.3.5 3 种酚同时与BSA 结合的荧光光谱 准确移 取2 mL Tris-HCl 缓冲液和30 μL 1.2×10-4mol/L BSA 标准溶液于3.5 mL 石英比色皿中，按1.3.4 节所推测结果依次加入20 μL 7.2×10-4mol/L 3 种酚溶液，每次加入后摇匀反应15 min，添加缓冲液至3 mL，以波长280 nm 为激发波长，激发和发射狭缝设定为2.5 nm 和5 nm，在298 K 下测定波长290～450 nm 的荧光光谱并记录。

1.3.6 分子模拟 采用AutoDock vina 4.0 软件研究多酚与BSA 分子对接。BSA（ID：4OR0）来源于RCSB PDB 数据库，去除b 链和水，QUE（Pub-Chem CID：5280343）、RES （PubChem CID：445154）和CAPE（PubChem CID：5281787）3D 结构来源于PubChem，通过默认设置与Gasteiger 电荷计算准备，BSA 和多酚结构都加入了氢原子[18]。为了探索BSA 中所有位点，设置了一个足够大网格框（x=82 Å、y=45 Å 和z=67 Å，间距为1.0 Å），以覆盖整个链A。对接过程中BSA 刚性对接配体柔性对接，并选择遗传算法设置搜索参数，所有其它参数都使用默认值。以最低能量对接构象选择最合适的结合模式，BSA 与多酚相互作用力由Discovery Studio v17.2.0 软件分析，分子对接3D 图由Pymol 2.2.0 软件呈现。

1.3.7 多酚的光稳定性研究 配制一系列与多酚相关的溶液，其中BSA、QUE、RES 和CAPE 浓度均为10 μmol/L，使用UV 灯（UVL-21，λ=365 nm）将待测液放置于离UV 灯约8～10 cm 远照射2 h，每隔0.5 h 使用紫外-可见分光光度计测定待测液中多酚含量。CAPE 含量（324 nm）根据标准曲线y=54.927x+0.0011 （R2=0.9992，0～0.015 mg/mL）计算；QUE 含量（374 nm）根据标准曲线y=0.0074x-0.0067（R2=0.9996，0～0.14 mg/mL）计算；RES 含量（306 nm）根据标准曲线y=0.134x+0.0486（R2=0.9994，0～0.016 mg/mL）计算。

1.4 统计分析

每个试验重复3 次，结果表示为x±s。采用Origin V 8.0 做图。采用SAS 8.0 软件（SAS Institute Inc.，NC，美国）的一般线性模型（GLM）进行方差分析。邓肯氏多重检验用来确定数据间的差异，显著水平为P＜0.05。

2 结果与讨论

2.1 多酚对BSA 的荧光猝灭作用

荧光团的光物理特性对周围环境的极性较敏感，蛋白-多酚结合的三级结构常用蛋白质内源荧光表征[14]。BSA 为内源性荧光物质，当激发波长为280 nm 时，荧光主要来源于色氨酸和酪氨酸残基[19]。图1为298 K 和310 K 下，分别存在3 种酚时BSA 的荧光发射光谱，由图中可知3 种酚均出现了荧光猝灭现象，但是猝灭程度不同。固定BSA浓度为1.2 μmol/L，随着加入的酚类物质的浓度增加（0～7.2 μmol/L），BSA 荧光强度呈现浓度依赖关系（见内插图），说明3 种活性成分与BSA 形成了蛋白-多酚复合物[3]。BSA 荧光强度最大吸收峰为340 nm，QUE 加入后最大吸收峰发生微弱蓝移（337 nm），RES 加入后最大吸收峰发生红移（348 nm），而CAPE 加入后最大吸收峰未发生移动。最大吸收峰的移动表明活性成分的加入改变了荧光团的微环境，红移极性增强蓝移疏水性增强，进一步说明形成了蛋白-多酚复合物，从而影响了蛋白质三级结构[20]。

图1 QUE（a，b）、RES（c，d）和CAPE（e，f）对BSA 的荧光猝灭作用Fig.1 Fluorescence quenching of BSA by QUE（a，b），RES（c，d）and CAPE（e，f）

2.2 荧光猝灭机理与热力学性质

有机分子猝灭的蛋白质的结合模式通常是动态猝灭或静态猝灭。动态猝灭意味着较高的温度会导致更快的扩散和更大数量的碰撞。相反，静态猝灭会产生稳定的配合物，并导致配合物在较高温度下发生解离[21]。Stern-Volmer 方程（1）和Hill方程（2）是分析荧光猝灭机理最常采用的方法[22]。

式中，F0——未加猝灭剂时的荧光强度峰值；F——加入猝灭剂时的荧光强度峰值；[Q]——猝灭剂浓度，mol/L；τ0——荧光分子的平均寿命，BSA 的τ0约为10 ns；Kq——双分子猝灭速率常数，L/mol·s；Ksv——Stern-Volmer 猝灭常数，L/mol；Ka为结合常数，L/mol；n——结合位点数，个。

由表1可知，3 种活性成分的Kq均大于1012L/mol·s（最大散射猝灭常数1010L/mol·s），说明均产生了静态猝灭，猝灭与形成BSA-多酚复合物有关[23]。当结合常数在1×104～15×104L/mol 范围时，配体以可逆的方式与蛋白质结合[24]，从Ka可以看出3 种活性成分与BSA 结合能力均较强，其中QUE 结合能力最强，RES 次之，CAPE 最弱，该结果与荧光发射光谱结果一致。

表1 多酚与BSA 相互作用的荧光猝灭常数Table 1 Fluorescence quenching constants of interaction between polyphenols and BSA

小分子与蛋白质等生物大分子之间的作用力包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等。当温差较小时，反应的焓变可看作常数。由Van's Hoff 方程（3）和热力学方程（4）可分别计算出吉布斯自由能ΔG、焓变ΔH 和熵变ΔS。

式中，R——摩尔气体常数，8.314 J/mol·K；T——温度，K；T1——温度1，K；T2——温度2，K；K——T 时的结合常数，L/mol；K1——T1时的结合常 数，L/mol；K2——T2时的结合常数，L/mol；ΔG——吉布斯自由能，kJ/mol；ΔH——焓变，kJ/mol；ΔS——熵变，J/mol·K。

由表2可知，3 种酚与BSA 的结合是自发进行（ΔG＜0）。QUE 的ΔH＜0，说明QUE 与BSA 的结合是放热过程，同时ΔS＜0 表明结合主要驱动力为为氢键和范德华力。RES 的ΔH＜0，说明RES 与BSA 的结合反应是放热反应，且ΔS＜0 表明分子间作用力主要为氢键和范德华力。CAPE 的ΔH＞0，说明CAPE 与BSA 结合反应是吸热反应，且ΔS＞0 表明分子间作用力主要为疏水相互作用，该结合是由熵驱动的过程。

表2 多酚与BSA 结合的热力学常数Table 2 Thermodynamic constants of the interactions between polyphenols and BSA

2.3 多酚与BSA 的结合位点分析

WARF 和IBU 与BSA 的亚结构域ⅡA（Sudlow’s sites I）和亚结构域ⅢA（Sudlow’s sites II）特异性结合，可作为位点标记物研究活性成分与BSA 的结合位点，因此通过比较位点标记物加入前、后淬灭率的变化就可以判断结合位点的位置[25]。

图2表示2 个位点Marker 对QUE、RES 和CAPE 与BSA 结合荧光光谱的影响。从图2a、2c和2e 可以看出，IBU 加入后3 种活性成分引起荧光猝灭变化规律相似，从内插图可以看出IBU的加入对BSA 淬灭率影响不大，表明3 种活性成分与BSA 的结合位点与IBU 结合位点不同，即它们与BSA 的结合不在亚结构域ⅢA 附近。从图2b、2d 和2f 可以看出，WARF 加入后3 种活性成分引起荧光猝灭变化规律不同，从内插图可以看出WARF 的加入对QUE 与BSA 的结合影响不大，而大大降低了RES 和CAPE 与BSA 的结合，表明QUE 与BSA 的结合位点不在WARF 结合位点附近，而RES、CAPE 与BSA 结合位点在WARF结合位点附近，即在亚结构域ⅡA 附近（Sudlow’s sites I）。

图2 IBU（6.0 μmol/L）或WARF （6.0 μmol/L）对QUE、RES 和CAPE 与BSA 结合荧光光谱的影响Fig.2 Effects of IBU （6.0 μmol/L） or WARF （6.0 μmol/L） on the fluorescence spectra of QUE，RES and CAPE binding to BSA

2.4 添加顺序对多酚与BSA 结合的影响

3 种酚与BSA 结合过程涉及到3 种活性成分的添加顺序。试验设计固定一种酚，然后添加另外2 种酚考察其对与BSA 结合的影响，最终结果如图3所示。

图3 QUE、RES 和CAPE 添加顺序对多酚与BSA 结合的影响Fig.3 Effects of addition sequence of QUE，RES and CAPE on binding of polyphenols to BSA

图3a 和3b 分别为RES 和CAPE 存在时对QUE 与BSA 结合的影响，从内插图可以看出两者的影响很相似，显著降低了QUE 对BSA 的荧光淬灭率（P＜0.05），因此推断RES 和CAPE 不能先于QUE 加入。图3e 和3f 分别为RES 和QUE 存在时对CAPE 与BSA 结合的影响，同样可以看出两者对于CAPE 与BSA 的结合没有显著的影响（P＞0.05），因此推断RES 和QUE 可以先于CAPE加入。图3c 和3d 分别为QUE 和CAPE 存在时对RES 与BSA 结合的影响，从内插图可以看出QUE的加入显著增强两者的结合（P＜0.05），而CAPE对于两者的结合没有显著的影响（P＞0.05），因此推断QUE 应先于RES 加入。综上考虑3 种酚的最佳加入顺序为QUE、RES、CAPE 或者RES、QUE、CAPE。

2.5 BSA-多酚复合物的形成

3 种多酚加入顺序对其与BSA 的结合影响如图4所示。从图4a 和4b 可以看出2 种加入顺序下荧光光谱的变化规律很相似，随着3 种多酚依次加入，荧光强度逐渐降低，终产物最大吸收波长均为342 nm。2 种添加顺序下形成产物分别为BSA+QUE+RES+CAPE 和BSA+RES+QUE+CAPE，它们对于BSA 荧光淬灭率分别为84.71%和79.55%，说明先加入QUE 更有利于酚与BSA 的结合。文献报道视黄醇、RES 和EGCG 可以同时结合到BSA 上形成多配体复合物[15]。综上说明BSA 可以同时结合RES/QUE/CAPE 中2 种或3 种多酚，形成了多配体-多酚复合物。

图4 BSA-多酚复合物荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of BSA-polyphenols complexes

2.6 分子模拟

本文采用Autodock 4.0 软件进行分子模拟研究，结果见图5。如图5a所示，按照QUE、RES 和CAPE 添加顺序得到BSA-三酚复合物最佳对接构象，结合ΔG 分别为-35.17，-36.43 kJ/mol和-34.33 kJ/mol。BSA 包含多个疏水腔，成为许多配体潜在的结合位点[26]。3 种酚可以同时结合到BSA 分子不同位点，由图5b 可知，RES 结合到Sudlow’s sites I 位点上，在主荧光氨基酸Trp213附近，由7 个氨基酸包围，分别与SER343 和TRP213 形成氢键和疏水相互作用，该结果与位点Marker 试验（图2c 和2d）结果一致。由图5d 可知，QUE 结合位点位于亚结构域IB 和IIIA 之间，远离Sudlow’s sites I 位点，而部分结合到Sudlow’s sites II位点的右侧氨基酸GLU424 和ARG458 上，分别与THR190、SER192 和GLU424形成氢键，位点Marker 试验（图2a 和2b）证明了这个结论。由图5c 可知，CAPE 结合位点位于IA和IIA 之间的疏水腔内，被TYR156、GLU152、TYR149、LEU259、ALA260、ILE289 和ALA290 包围，位点部分结合于Sudlow’s sites I，而不与Sudlow’s sites II 位点结合，该结果同样可以被位点Marker 试验（图3e 和3f）证实。

图5 CAPE、RES 和QUE 与BSA 的结合位点氨基酸及作用力Fig.5 The binding sites of amino acids and forces of interaction between CAPE，RES，QUE and BSA

2.7 多酚光稳定性研究

QUE 的稳定性受溶剂、温度、酸碱性、光照等多方面影响[27]。由图6a所示，随着紫外暴露时间的延长，保留率逐渐下降，与BSA 结合后保留率显著提高，2.0 h 由52.2%提高到71.4%（BSA+QUE+RES+CAPE），而没有与BSA 结合，同时存在RES 或CAPE 时对于提高保留率无显著作用，说明BSA-多酚复合物的形成有效的保护了QUE。

RES 在光、温度和pH 条件下容易发生降解和异构化，研究表明反式RES 经光照后可转换成顺式RES，自然界中主要以反式为主[28]。图6b 为光处理后RES 的保留率，光处理0.5 h 后游离RES 损失近50%，到2.0 h 保留率降为31.5%，当仅存在QUE、CAPE 时RES 保留率变化不大，而与BSA 结合后有3 组RES 保留率显著的高于其它组，最高达到83.2%，说明BSA-多酚复合物的形成有效地保护了RES 增强了光稳定性。

由图6c 可知，各组CAPE 保留率随着紫外暴露时间的延长而逐渐降低。与游离CAPE 相比，RES、QUE 的加入使得保留率小幅度提高，而与BSA 结合的各组与其它组相比显著提高了保留率，并随着时间的延长效果更明显，2.0 h BSA+QUE+CAPE 保留率最高可达75.7%，BSA+QUE+RES+CAPE （75.1%）与其无显著性差异。说明BSA-多酚复合物的形成有效地保护了CAPE，增强了光稳定性。

图6 BSA 对QUE、RES 和CAPE 紫外处理后保留率的影响Fig.6 Effects of BSA on retention rates of QUE，RES and CAPE by UV treatments

3 结论

论文采用荧光光谱法研究了QUE、RES 和CAPE 单独或同时与BSA 结合的荧光猝灭机制，通过Stern-Volmer 方程和Hill 方程分析了结合常数和结合位点数，通过热力学分析确定了作用力类型，通过位点Marker 竞争试验结合分子模拟确定了结合位点关键氨基酸及相互作用力。结果表明，BSA 可以同时结合2 个或3 个配体形成蛋白-多酚复合物，多酚添加顺序影响其结合能力。复合物的形成改善了游离多酚的稳定性，两配体和三配体复合物对多酚的保护作用优于单配体复合物。论文结果表明，开发基于蛋白基载体实现多种活性成分的共装载是可行的且具有重要意义。