刘盼盼，郑鹏程，龚自明*，冯 琳，郑 琳，高士伟，滕 靖，王雪萍，陈军海

（1 湖北省农业科学院果树茶叶研究所 青砖茶湖北省工程研究中心 武汉 430064 2 湖南农业大学 茶学教育部重点实验室 长沙 410128 3 湖北省赵李桥茶厂有限责任公司 湖北赤壁 437318）

青砖茶，我国三大边销砖茶之一，一直是我国边疆少数民族同胞日常生活必需品，主产于鄂南的赤壁、咸宁、通山、崇阳和通城等地区，是通过晒青毛茶在高温、高湿的环境中以及微生物的参与下，经特殊后发酵工艺制成的发酵茶[1-2]。由于成品茶滋味醇和回甘，香气陈醇，具有降脂减肥等诸多保健功效[3-6]，因此受到越来越多内陆消费者的关注和喜爱。然而，很长一段时期内，青砖茶都是“政策性商品、定点生产、统购统销”，与外界沟通较少，产业较为封闭，业内对其加工技术的研究较其它茶类少，严重阻碍了青砖茶产业的健康快速发展。

国内外研究表明，黑茶渥堆发酵过程是以茶叶为基质，在水分的湿热作用和微生物作用协同下，发生一系列氧化、水解、聚合和次生代谢转化等反应，促进茶叶内含物质发生变化，对于茶叶品质形成具有关键作用，是黑茶品质形成的关键工艺[7-10]。目前青砖茶的渥堆发酵一般采用传统的人工操作，晒青毛茶通过潮水、渥堆、翻堆等工序并依靠环境微生物进行自然发酵，该渥堆方法存在发酵周期长、品质不稳定、生产效率低等问题，已成为阻碍青砖茶产业发展的主要因素。如何结合品质调控的要求，实现由传统工艺向机械化、标准化加工工艺转变，将是未来青砖茶工艺改进的方向。近年来，有部分学者开展了有关黑茶发酵品质和设备等方面的研究，如王兴华等[11]比较了数控与传统发酵普洱茶的品质及化学成分，发现数控发酵速度更快，香气更好。杨光等[12]设计一种黑茶翻堆设备，提高了生产效率。蒋小平等[13]对湖南黑毛茶渥堆发酵机械化生产的研究表明，经发酵罐渥堆的黑毛茶发酵均匀，操作易于控制，且卫生干净。通过黑茶加工机械化的实现，可以改善其产品品质，提升黑茶产业的整体质量水平。

本文从实际生产出发，采用正交试验研究青砖茶关键渥堆发酵工艺参数（潮水量、渥堆温度、渥堆时间、翻堆次数和相对湿度），通过考察不同理化指标，结合化学成分变化和感官评定筛选出品质最优的试验组，并用国标法、HPLC 和HSSPME-GC-MS/O 等技术检测分析青砖茶产品的挥发性风味物质，为今后指导青砖茶全程机械化智能化生产提供试验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜叶原料为湖北省农业科学院果树茶叶研究所实验茶场的颚茶1 号品种，于2019年4月份按一芽五叶标准进行采摘。鲜叶经过杀青-揉捻-晒干加工成晒青毛茶[14]，取样后筛分去末并密封装袋，于-4 ℃冷藏待测。

色谱级甲醇、乙腈、乙酸，美国Fisher 公司；儿茶素品系、咖啡碱，美国Sigma Aldrich 公司；福林酚、蒽酮、茚三酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化亚锡、正丁醇、乙酸乙酯，国药集团化学试剂有限责任公司，其余均为色谱纯级或分析纯级试剂。

1.2 仪器与设备

Waters 2695 高效液相色谱、2998 PDA 检测器，美国Waters 公司；手动SPME 进样器和50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头，美国Supeclo公司；7890 A 气相色谱仪、5975 C 质谱仪，美国Agilent 公司；ODP3 闻香仪，德国Gerstel 公司；HHS 型恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；UV-2550 紫外-可见光分光光度计，日本岛津公司；Milli-RO PLUS 30 纯水机，法国Millipore 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 渥堆工艺流程

1）数控渥堆处理 每组称取2 kg 晒青毛茶，之后以纯净水调节其水分含量，拌匀静置2 h使其水分充分浸润茶叶，放入不锈钢发酵桶中（不密封），在设定试验条件下，于可控温控湿的发酵箱中进行渥堆发酵，并放入温湿度计探头，自动记录发酵过程中堆内温度及湿度。

2）传统渥堆处理 每组称取2 kg 晒青毛茶，之后以纯净水调节其水分含量，拌匀静置2 h使其水分充分浸润茶叶，用尼龙网袋装好后放入自然发酵的茶堆中（距离堆表1m），并放入温湿度计探头，自动记录发酵过程中堆内温度及湿度。传统渥堆试验在湖北省赵李桥茶厂有限责任公司开展。

1.3.2 青砖茶渥堆工艺优化单因素实验 依次改变影响青砖茶品质的主要渥堆条件：潮水量、渥堆温度、渥堆时间、翻堆次数及相对湿度，以感官评价为考察指标，具体设计见表1。

表1 单因素试验因子与条件Table 1 Factors and condition of single factor test

1.3.3 青砖茶渥堆工艺优化正交试验 以单因素实验结果确定四因素三水平的最佳参数 （表2），根据感官评价以及化学成分变化进行正交分析。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels orthogonal text

1.3.4 基本成分测定 水浸出物含量的测定采用恒温干燥法[15]；茶多酚含量的测定采用福林酚试剂比色法[16]；氨基酸总量的测定采用茚三酮比色法[17]；可溶性总糖的测定采用蒽酮－硫酸法[18]；黄酮化合物含量的测定采用三氯化铝法[18]；茶色素总量采用系统分析法[19]。

1.3.5 感官评价方法 根据GB/T 23776-2018《茶叶感官审评方法》中的黑茶（散茶）审评法，由3 名专业人员对样品的外形、汤色、香气、滋味进行感官审评，采用十分制（0～2 微强，2～4 较强，4～6强，6～8 很强，8～10 极强）。

1.3.6 顶空固相微萃取法 根据GB/T 8303-2013 《茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定》中的紧压茶试样制备法，取出粉末茶样，混匀、磨碎，然后称取1 g 茶样放入萃取瓶中，加入30 mL沸水和一定量内标（癸酸乙酯），然后将装有50/30 μm DVB/CAR/PDM 萃取头的SPME 手持器通过瓶盖的橡皮垫插入到萃取瓶中，在60 ℃水浴中平衡10 min，推出纤维头，吸附50 min 后，取出并立即插入气相色谱仪的进样口中，解吸附3 min，同时启动仪器收集数据。

1.3.7 气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析

1）GC 条件 安捷伦HB-5MS （30 m×0.32 mm，0.25 μm）弹性石英毛细管柱，进样口温度为240 ℃，载气为高纯氦气，流速1.8 mL/min。

2）柱温程序 50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min 升至250℃保持3 min；试验中尽量将峰分开，保证峰形的对称完整，然后通过质谱进行定性分析。

3）MS 条件 EI 电离能量为70 eV，质量扫描范围为40～500 amu，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，质谱传输线温度为280 ℃。

4）物质鉴定 利用NIST11.L 谱库对得到的质谱图进行串连检索和人工解析。査阅有关质谱资料，对基峰、质核比和相对峰度等进行分析，结合保留时间和质谱分别对各峰加以确认。采用内标癸酸乙酯定量香气成分，公式如下：

待测物质量浓度（μg/L）=癸酸乙酯质量浓度×待测物峰面积/癸酸乙酯峰面积

1.3.8 GC-MS/O 分析 气相色谱-质谱条件同1.3.7 节。

嗅闻条件：嗅闻系统传输线温度220 ℃，嗅闻口温度200 ℃，加湿器流速12 mL/min。流出成分在毛细管末端以1∶1 的分流比流入闻香器。载气为氮气，流速为1 mL/min。

挑选3 名经过专业闻香培训的品评人员进行闻香分析。应用时间强度法，记录香气出现时间和香气特征，香气强度以0～4 5 个级别表述（“0”表示未闻到，“2”表示香气强度中等，“4”表示香气强度非常强）每人对每个组分闻香2 次，每个化合物的香气强度为6 次闻香结果的平均值。

1.4 数据分析

采用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA）及Duncan 法多重比较。

2 结果与分析

2.1 青砖茶渥堆发酵条件的单因素结果

渥堆发酵条件对微生物生长及青砖茶的品质有较大影响。由图1a 可知，随着潮水量增加，感官评分呈先增大后减少趋势。潮水量40%与45%的茶堆在发酵前期容易霉变，发酵结束后叶色发枯，因此潮水量不宜超过40%。潮水量25%的茶堆在翻堆2 次后水分含量较低，导致后期发酵程度不足。当潮水量为35%时，发酵叶外形较优，但其内质分略低，故选择潮水量为30%。渥堆时水分含量对渥堆过程中的微生物种群演化有显著影响，最终影响品质成分的形成和积累[20]。由图1b 可知，随着渥堆温度增加，感官评分呈增大趋势。茶堆在35 ℃和40 ℃条件下渥堆发生了霉变，干茶叶色发枯，因此渥堆温度不宜低于40 ℃。60 ℃条件下，样品的滋味略带酸，故选择渥堆温度为55 ℃。温度影响着茶叶中微生物的生长速率与酶的活性，提高堆外温度，可以相应地促进渥堆进程，缩短渥堆时间，然而堆外温度过高对叶色和香气有不良影响，另外有机酸等物质较多积累可能使滋味变酸[21]。

由图1c 可知，随着渥堆时间增加，感官评分呈先增大后减少趋势。发酵10 d 与15 d 香气未出现陈香，发酵25 d 后滋味带酸，因此综合考虑以发酵时间20 d 为宜。由图1d 可知，随着相对湿度增加，感官评分呈增大趋势。相对湿度低于70%条件下发酵程度低，香气不带陈香，滋味带青味，相对湿度90%和100%条件下发酵叶品质较好，但是相对湿度100%的样品香气略带闷味，故选择相对湿度为90%。由图1e 可知，随着翻堆次数增加，感官评分呈先增大后减少趋势。翻堆1～2 次的样品香气有闷味，滋味带酸味，翻堆5～6 次的样品外形和汤色分值较低，考虑到生产效率，故选择翻堆3次。由于渥堆过程中一部分的物质变化是氧化作用，如茶多酚的氧化需要氧气，才能形成青砖茶特有的色香味，因此适度的翻堆可以促进物质转化，降低无氧发酵对品质的影响[22]。

图1 潮水量（a）、渥堆温度（b）、渥堆时间（c）、相对湿度（d）及翻堆次数（e）对青砖茶品质影响Fig.1 Effect of additional quantity of water （a），pile-fermentation temperature （b），pile-fermentation time （c），relative humidity （d）and turn number （e）on the quality of Qingzhuan tea

2.2 正交试验结果和方差分析

通过研究单因素的影响条件，确定最佳的单因素实验条件范围，以此为基础设计正交试验方案，以感官总分、茶多酚减少量、氨基酸减少量、可溶性糖增加量和茶褐素增加量为考察指标，分析渥堆条件对青砖茶感官品质及主要化学成分的影响，正交结果见表3。

方差分析发现潮水量、渥堆温度、渥堆时间和相对湿度对青砖茶渥堆发酵结束后茶叶中的茶多酚、水溶性糖、游离氨基酸、茶褐素的含量与感官总分的影响无显著差异（F 值均＜F0.05=4.46）。极差分析青砖茶渥堆发酵工艺正交试验结果（表3）发现：对茶多酚减少量影响最大的是渥堆温度（Rj=5.83）、其次是时间（Rj=5.33），渥堆后茶多酚减少量较少的组合是A2B2C3D3（潮水量30%、温度55℃、时间25 d、相对湿度95%）；对氨基酸减少量影响最大的是渥堆温度 （Rj=14.783）、其次是时间（Rj=5.15），渥堆后氨基酸减少量较少的组合是A3B3C2D1（潮水量32%、温度60 ℃、时间20 d、相对湿度85%）；对可溶性糖增加量影响最大的是潮水量（Rj=71.76）、其次是时间（Rj=39.326），渥堆后可溶性糖增加量较多的组合是A2B2C1D2（潮水量30%、温度55 ℃、时间15 d、相对湿度90%）；对茶褐素增加量影响最大的是渥堆时间（Rj=15.073）、其次是温度（Rj=12.674），渥堆后茶褐素增加量的较多组合是A2B2C3D3（潮水量30%、温度55 ℃、时间25 d、相对湿度95%）；对感官总分影响最大的是潮水量（Rj=1.926）、其次是温度（Rj=1.174），渥堆后感官总分的较优组合是A2B3C3D1（潮水量30%、温度60 ℃、时间25 d、相对湿度85%）。综合分析正交试验结果发现，在青砖茶渥堆发酵阶段对其品质及化学成分影响较大的因素是潮水量、渥堆温度和渥堆时间，最佳的工艺应为潮水量30%、渥堆温度55 ℃、时间25 d、相对湿度95%。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment

为了验证最佳工艺条件，在最佳渥堆艺条件下做3 次验证试验，验证试验平均结果为：感官总分88.60、茶多酚减少量49.20%、氨基酸减少量63.66%、可溶性糖增加量85.11%、茶褐素增加量68.42%，与预测值较为接近，说明正交分析法得出的青砖茶渥堆工艺条件可靠。

2.3 数控渥堆样与传统渥堆样的品质及风味成分比较分析

2.3.1 感官品质与理化成分比较分析 分别采用传统工艺与数控发酵系统发酵青砖茶，记录堆内茶叶温度与湿度。由图2可知，传统茶堆发酵中茶坯逐渐升温，堆内温度与湿度不完全可控，最高温度升至63 ℃，最高相对湿度升至94%，其温度与相对湿度主要与当地气候相关。另外，传统发酵如果发酵堆太小，可能导致茶堆温度不能上升，存在所谓“冷发酵”问题，降低发酵品质。数控系统可以通过监测与加温加湿控制发酵室温度和湿度，即使少量毛茶发酵也可以快速上升至设定温度与湿度（50 ℃、90%），且堆温与堆内湿度较稳定，有利于保证发酵的均匀度。

图2 2 种渥堆方式中茶样温度与湿度的变化规律Fig.2 Changes of temperature and humidity of tea samples in two piling modes

为了验证数控渥堆参数在生产中应用性，将同一毛茶原料的数控渥堆样与传统渥堆样的品质进行对比分析，其感官品质及化学成分如表4所示。与毛茶相比，数控渥堆样和传统渥堆样感官品质发生了显著改变，香气由纯正、熟栗香转变陈香，滋味由醇和、略带涩味转变为陈醇。2 个渥堆样品感官品质较为一致，都表现为陈香、滋味陈醇，而数控渥堆样品滋味有回甘，略优。与晒青毛茶相比，渥堆结束后茶样的品质化学成分发生了一系列变化，数控渥堆样与传统生产渥堆结束样的水浸出物、茶多酚、氨基酸、儿茶素总量与茶红素含量显著降低，可溶性糖和茶褐素含量显著升高，而咖啡碱、黄酮与茶黄素含量无显著变化。数控渥堆样与传统渥堆样在化学成分变化方面呈现一致性，但其变化幅度较大。对其它黑茶的研究表明[23-25]，在微生物的作用下，渥堆过程中多酚氧化酶、纤维素酶、果胶酶等活性增强，茶多酚、氨基酸、儿茶素等含量减少，转化为茶褐素等物质，还有少部分多酚类化学成分在微生物分泌的胞外酶的作用下发生了化学结构修饰。

表4 晒青毛茶、数控渥堆样与传统渥堆样品质及化学成分比较分析Table 4 Comparative analysis of quality and chemical components in sun-dried green tea，numerical control fermented tea leaves and traditional fermented tea leaves

2.3.2 香气成分比较分析 晒青毛茶、数控渥堆与传统渥堆样品的香气成分含量及种类见表5。原料晒青毛茶检出44 种香气成分，醇类（48.86 μg/L）和醛类（21.92 μg/L）是主导香气化合物，主要香气成分有芳樟醇、芳樟醇氧化物、壬醛、1-辛烯-3-醇、香叶醇等。研究表明芳樟醇及其氧化物、香叶醇具有花香，壬醛呈现果香，是绿茶中主要香气活性成分[26-27]。数控渥堆样以醛类（52.43 μg/L）和酮类（19.16 μg/L）为主，其中醛类主要为（E，E）-2，4-庚二烯醛、己醛、壬醛、（E）-2-己烯醛等，以烯醛类物质为主。酮类物质主要为β-紫罗酮、（E）-香叶基丙酮、3，5-辛二烯-2-酮等。（E，E）-2，4-庚二烯醛等烯醛类物质对青砖茶陈香风味贡献较大[28]，而β-紫罗酮、（E）-香叶基丙酮等对花香、木香风味有直接贡献，由β-胡萝卜素氧化降解产生[29-30]。传统渥堆茶样的香气以醛类和醇类为主，分别为34.35 μg/L 和21.32 μg/L。醛类物质主要为（E，E）-2，4-庚二烯醛、己醛、壬醛、（E）-2 辛烯醛等；醇类物质主要为芳樟醇、芳樟醇氧化物和香叶醇等。

表5 晒青毛茶、数控渥堆样与传统渥堆样的香气成分比较分析Table 5 Comparative analysis of aroma components in sun-dried green tea，numerical control fermented tea leaves and traditional fermented tea leaves

（续表5）

晒青毛茶潮水渥堆过后，其香气成分发生了巨大的变化，除去烷烃类成分，从香气物质的类型看，晒青毛茶与渥堆茶样以醇类、醛类、酮类和烯类为主，渥堆过程中晒青毛茶的醇类和酯类成分大幅减少，传统渥堆减幅在50%以上，而数控渥堆减幅达80%以上，渥堆结束后醛类、酮类、烯类和杂环类物质含量大幅上升，可见数控渥堆的发酵程度较传统渥堆更深。

由表6可知，晒青毛茶及其渥堆样品经过GC-MS/O 分析，共检测到12 种香气活性物质，其中6 种香气成分的香气强度（AI）≥2.0，对青砖茶的风味有较大贡献，分别为（E，E）-2，4-庚二烯醛（陈味）、β-紫罗酮（花香、木香）、芳樟醇（花香）、（Z）-4-庚烯醛（树叶）、（E）-2-壬烯醛（树叶）和香叶醇（花香），这些香气活性成分风味强度的变化是青砖茶晒青毛茶风味由绿茶香向陈香转变的重要物质基础。

表6 GC-O 分析比较晒青毛茶、数控渥堆样与传统渥堆样的香气活性成分Table 6 GC-O analysis of aroma-active components in sun-dried green tea，numerical control fermented tea leaves and traditional fermented tea leaves

3 结论

利用正交试验对青砖茶渥堆发酵条件进行优化，得到最佳发酵工艺条件：潮水量30%、渥堆温度55 ℃、时间25 d、相对湿度95%，在此条件下制成的青砖茶陈香明显，滋味陈醇、有回甘。晒青毛茶渥堆后化学成分发生了一系列变化，除了咖啡碱、黄酮与茶黄素较稳定外，水浸出物、茶多酚、氨基酸、儿茶素总量与茶红素含量减少，而可溶性糖和茶褐素明显增加，另外数控渥堆样与传统渥堆样在化学成分变化规律方面呈现一致性，但其变化幅度更大。采用HS-SPME-GC-MS 对晒青毛茶和渥堆样的挥发性物质进行检测，共检测到57 种挥发性物质，包括醛类、醇类、酮类、烯类、酯类、杂环类和其它类等。渥堆过程中晒青毛茶的醇类和酯类成分大幅减少，其中传统渥堆减幅约为50%以上，而数控渥堆减幅达80%以上，渥堆结束后醛类、酮类、烯类和杂环类大幅上升，可见数控渥堆的发酵程度较传统渥堆更重。GC-MS/O 分析得到12 种香气活性物质，其中6 种香气成分（AI≥2.0）对青砖茶的风味有较大贡献，分别为（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-紫罗酮、芳樟醇、（Z）-4-庚烯醛、（E）-2-壬烯醛和香叶醇，这些香气活性成分的改变是青砖茶晒青毛茶风味由绿茶香向陈香转变的重要物质基础。