倪建腾，马致洁，赵奎君，章从恩，陈 熹

(首都医科大学附属北京友谊医院中药剂科，北京 100050)

近年来，鲍曼不动杆菌已成为全球卫生领域的最大难题[1-9]。目前临床的主要治疗药物为抗菌药物，但课题组前期研究结果发现，由于鲍曼不动杆菌耐药性强、抗菌药物滥用等原因，导致其治疗一直受到很大阻力[10-11]。盐酸小檗碱与黄芩苷对鲍曼不动杆菌有一定的体外抑制作用[12-16]。代谢组学可以从整体层面上以微观角度研究机体代谢的状况，发现可观测、可认识的物质基础，并分析推理，筛选出有意义的功能信息进行归纳和整合，清晰并系统地认识复杂体系[17]。利用代谢组学可确定中药干扰鲍曼不动杆菌代谢物质的变化，对研究中药抑菌能力具有重要的意义。

1 材料

1.1 仪器

NV-425-400s Labgard型生物安全柜(新加坡艺思高科技有限公司)；99234型麦氏比浊仪(梅里埃生物制品有限公司)；12孔平底培养板(康宁公司)；NV-5510E型恒温细菌培养箱(北京诚茂兴业科技发展有限公司)；101-1A型干燥器(泰斯特)；涡旋混合器(上海五相仪器仪表有限公司)；5424R型离心机(艾本德股份公司)；10、200及1 000 μl的移液器(艾本德股份公司)；BSA224S-CW型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；Gradient A10 Mill-Q超纯水器(法国 Millipore 公司)；LC-IT-TOF/MS型液相色谱串联离子阱飞行时间质谱(日本岛津公司)，Inertsil ODS-SPC18色谱柱(日本岛津公司)，LC-MS solution 工作站。

1.2 菌株

鲍曼不动杆菌标准菌株(中国工业微生物菌种保藏管理中心)。

1.3 药品与试剂

黄芩苷(中国药品生物制品检定所)；盐酸小檗碱标准品(中国药品生物制品检定所)；替加环素标准品(浙江海正药业股份有限公司)；肉汤粉(北京陆桥技术有限责任公司)；吐温-80(迈瑞达)；二甲基亚砜(Sigma公司)；0.9%氯化钠溶液(石家庄四药有限公司)；甲醇(Fisher Scientific)；三氯甲烷(北京化工厂)；甲酸(Dikmapure公司)。

2 方法

2.1 菌株复苏

取冻存的鲍曼不动杆菌标准菌株干粉用肉汤溶解稀释，35 ℃条件下培养24 h复苏。将复苏后的菌株用细菌接种环蘸取少量菌液划种于血平板，继续在35 ℃条件下培养24 h。选取单克隆菌株置于肉汤中增菌(此时为对数生长期，对数生长期的细菌对外界环境因素敏感，代谢旺盛)。最后用肉汤稀释至浓度为(1.00～1.50)×106CFU/ml，混匀备用。

2.2 药物制备

2.2.1 黄芩苷溶液制备：取适量黄芩苷标准品置于干燥器中30 min后溶于二甲基亚砜中，配至浓度为10.34 mmol/L，取290 μl于盐钵中，加入吐温-80 0.40 ml研匀，用肉汤定容至1.50 ml，得到2 000.00 μmol/L黄芩苷工作液，进一步稀释至200.00 μmol/L，混匀备用。

2.2.2 盐酸小檗碱溶液制备：同“2.2.1”项下黄芩苷溶液制备方法，得到200.00 μmol/L盐酸小檗碱溶液，混匀备用。

2.3 样品制备与处理

2.3.1 样品制备：取盐酸小檗碱溶液400 μl依次加入12孔板的A行1至6列、B行1至3列，取菌液400 μl加入A行1至6列、B行4至6列，不满1 ml的孔均用肉汤补齐。此时B行1至3列为空白组，B行4至6列为对照组，A行1至6列为盐酸小檗碱组。黄芩苷标本制备方法同盐酸小檗碱。此时，盐酸小檗碱与黄芩苷的终浓度均为80.00 μmol/L，鲍曼不动杆菌的终浓度为(2.00～3.00)×105CFU/ml(上述体系中DMSO含量均≤1%，可忽略其对菌体生长的影响)，轻微震荡混匀并在35 ℃条件下培养16 h[18]。

2.3.2 样品处理：为提高样品制备的效率，本研究对提取溶剂种类和提取条件等参数进行优化。经测试后，氯仿-甲醇-水混合物(V∶V∶V=1∶3∶1)产生最大数量的峰，故选择其为提取溶剂。收集各组细菌培养液1 ml，并立即将其转移到冰上，并在冰上迅速进行以下步骤，将1 ml细菌培养液离心10 min(3 220转，4 ℃)，取上清液，并迅速使用0.22 μmol/L膜过滤器过滤，取滤液50 μl与氯仿-甲醇-水(V∶V∶V=1∶3∶1)1.25 ml轻摇混匀，离心10 min(14 000转，4 ℃)，收集上清液，得到细胞外代谢物溶液，备用。

2.3.3 色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS-SPC18柱；流动相为水(A)-甲醇(B)，色谱梯度洗脱条件见表1；流速为0.3 ml/min；进样量为5 μl；柱温为25 ℃；样品温度为4 ℃；检测波长为420 nm。

表1 梯度洗脱条件Tab 1 Chromatographic gradient elution conditions

2.3.4 质谱条件：电喷雾化离子源，ESI-(120 ℃)；毛细管电压为3 200 V；质量扫描范围(m/z)为50～1 000；脱溶剂气流量为6.0 L/min；脱溶剂温度为180 ℃。

2.4 数据分析

将所有数据进行预处理，并进行归一化，后导入SIMCA-P11.0软件中进行多变量数据分析，包括主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)。其中，使用OPLS-DA分析方法挖掘黄芩苷组与对照组、盐酸小檗碱组与对照组间的内在差异，利用OPLS-DA模型中的S-plot图与VIP值(与预测变量相关性高的变量)初步筛选差异代谢物。筛选条件为VIP>2，∣p(corr)∣≥0.58。并进一步利用MetaboAnalyst在线软件对上述条件得到的差异代谢物进行T检验与ANOVA检验，筛选条件为P<0.05、FC<0.5或>2、FDR<0.05，即得到候选差异代谢物。最后，利用Metlin数据库初步分析候选差异代谢物的质核比，依据各变量的精确分子量并结合同位素丰度信息进行初步鉴定，质量误差在10 ppm以内。再利用MetaboAnalyst在线软件进行代谢通路富集分析。

3 结果

3.1 数据主成分分析

观察三组鲍曼不动杆菌样品的PCA得分图(见图1)，在正离子模式下，质量控制组与其他三组分离程度较好，且聚集程度较高，表明在分析过程中实验条件较稳定，数据可信度高；质量控制组分类趋势较好，说明在分析过程中方法稳定性较好；另外，黄芩苷组、盐酸小檗碱组均从对照组中分离出来，且分离程度较好，可证明三组的代谢差异比较明显，外源性代谢物水平分别受到黄芩苷与盐酸小檗碱的干扰。

图1 对照组、质量控制组、盐酸小檗碱组和黄芩苷组鲍曼不动杆菌的PCA得分图Fig 1 PCA scores of Acinetobacter baumannii in the control group, quality control group, berberine hydrochloride group and baicalin group

3.2 黄芩苷与盐酸小檗碱差异代谢物的初步筛选

对照组和黄芩苷组在OPLS-DA模型中分离度良好，见图2；对照组和盐酸小檗碱组在OPLS-DA模型中分离度良好，见图3；而且，各模型关键参数R2Y (cum) 和Q2Y (cum)在配对组均>0.5，说明各模型均具有较强的可信度与较好的预测性。使用OPLS-DA中的S-plot图与VIP值对所有变量进行初步筛选。筛选条件为VIP>2，∣p(corr)∣≥0.58，见图4—5(图中深色圆点即为筛选结果)。使用MetaboAnalyst进行T检验与ANOVA检验，筛选条件为FDR<0.05、P<0.05、FC<0.5或>2，初步确定鲍曼不动杆菌被不同药物干预后的差异代谢物，即候选差异代谢物。

图2 对照组、黄芩苷组之间配对比较的OPLS-DA得分图Fig 2 OPLS-DA scores of paired comparison between the control group and the baicalin group

图3 对照组、盐酸小檗碱组之间配对比较的OPLS-DA得分图Fig 3 OPLS-DA scores of paired comparison between the control group and the berberine hydrochloride group

图4 对照组、黄芩苷组之间配对比较的S-plot得分图Fig 4 S-plot score of paired comparison between control group and baicalin group

图5 对照组、盐酸小檗碱组之间配对比较的S-plot得分图Fig 5 S-plot scores of paired comparison between the control group and the berberine hydrochloride group

3.3 黄芩苷与盐酸小檗碱候选差异代谢物的初步鉴定

将上述候选差异代谢物的质核比导入Melin数据库进行初步鉴定，鉴定过程相关数据见表2—4。

综合表2—4的结果可知，初步鉴定差异代谢物14个。黄芩苷给药后的差异代谢物共有9种，包括“Tyramine”(酪胺)、“Melibionate”“Glycerophosphoglycerol”“Succinyladenosine”“UDP-N-acetyl-D-glucosamine”“Caproylcholine”(己基胆碱)、“N-Acetyl-L-leucine”“Aspartylysine”(天冬氨酸)和“L-Cysteine”(L-半胱氨酸)等；盐酸小檗碱给药后的差异代谢物共有9种，包括“Tyramine”(酪胺)、“Melibionate”“N-(L-Arginino)succinate”“Uridine triphosphate”(尿苷三磷酸)、“Xanthosine 5′-phosphate”“D-Erythrose 4-phosphate”“N-Acetyl-L-leucine”“Aspartylysine”(天冬氨酸)和“Glutathione disulfide”等。其中，共有差异代谢物共有4种，包括“Tyramine”(酪胺)、“Melibionate”“N-Acetyl-L-leucine”和“Aspartylysine”(天冬氨酸)等。另外，观察表2中的FC值可知，14种差异代谢物的含量在给药后发生了显著变化。

表2 黄芩苷组和对照组、盐酸小檗碱组和对照组差异代谢物的筛选过程数据Tab 2 Screening process data of different metabolites in the baicalin group and the control group, the berberine hydrochloride group and the control group

在黄芩苷组与对照组的评估中，共有“Tyramine”(酪胺)、“Melibionate”“Glycerophosphoglycerol”“Caproylcholine”(已基胆碱)、“N-Acetyl-L-leucine”“Aspartylysine”(天冬氨酸)和“L-Cysteine”(L-半胱氨酸)等7种差异代谢物含量显著下调；仅有“Succinyladenosine”“UDP-N-acetyl-D-glucosamine”等2种差异代谢物含量显著上调，见图6。表明黄芩苷以不同的方式干扰了鲍曼不动杆菌的代谢途径。

表3 黄芩苷组和对照组、盐酸小檗碱组和对照组差异代谢物的筛选过程数据续Tab 3 Screening process data of different metabolites in the baicalin group and the control group, the berberine hydrochloride group and the control group

表4 差异代谢物的鉴定结果Tab 4 Identification results of different metabolites

在盐酸小檗碱与对照组的评估中，共有9种代谢产物发生了显著变化，其中，“Tyramine”(酪胺)、“Melibionate”“Xanthosine 5′-phosphate”“N-Acetyl-L-leucine”和“Aspartylysine”(天冬氨酸)等5种差异代谢物含量显著下调；“N-(L-Arginino)succinate”“Uridine triphosphate”(尿苷三磷酸)、“D-Erythrose 4-phosphate”和“Glutathione disulfide”等4种差异代谢物含量显著上调，见图7。表明盐酸小檗碱以不同的方式干扰了鲍曼不动杆菌的代谢途径。

3.4 基于黄芩苷与盐酸小檗碱的代谢通路富集分析

3.4.1 黄芩苷代谢通路富集分析：对上述9个差异代谢物进行通路富集分析，主要有10个代谢通路受到了影响，见图8—10。主要的通路包括：“Homocysteine Degradation”“Taurine and Hypotaurine Metabolism”“Glutathione Metabolism”(谷胱甘肽代谢)、“Pantothenate and CoA Biosynthesis”“Cysteine Metabolism”(半胱氨酸代谢)、“Galactose Metabolism”(半乳糖代谢)、“Methionine Metabolism”“Glutamate Metabolism”(谷氨酸代谢)、“Glycine and Serine Metabolism”及“Tyrosine Metabolism”(酪氨酸代谢)等。

A.对照组和黄芩苷组之间的Fold Change值对比图(n=6，FC<1)； B.对照组和黄芩苷组之间的Fold Change值对比图(n=6，FC>1)；与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01A.comparison of Fold Change values between the control group and the baicalin group (n=6, FC<1)；B.comparison of Fold Change values between the control group and the baicalin group (n=6, FC>1)；vs. the control group, *P<0.05，**P<0.01图6 对照组和黄芩苷组之间的Fold Change值对比图(n=6)Fig 6 Comparison of Fold Change values between the control group and the baicalin group (n=6)

A. 对照组和盐酸小檗碱组之间的Fold Change值对比图(n=6, FC<1)；B. 对照组和盐酸小檗碱组之间的Fold Change值对比图(n=6, FC>1)； 与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01A.comparison of Fold Change values between the control group and the berberine hydrochloride group (n=6, FC<1)；B. comparison of Fold Change values between the control group and the berberine hydrochloride group (n=6, FC>1)；vs. the control group, *P<0.05，**P<0.01图7 对照组和盐酸小檗碱组之间的Fold Change值对比图(n=6)Fig 7 Comparison of Fold Change values between the control group and the berberine hydrochloride group (n=6)

图8 黄芩苷组9种差异代谢物代谢通路富集分析图Fig 8 Enrichment analysis of 9 differential metabolite metabolic pathways in the baicalin group

3.4.2 盐酸小檗碱代谢通路富集分析：对9个差异代谢物进行通路富集分析，主要有16个代谢通路受到了影响，见图11—13。主要的通路包括：“Glutamate Metabolism”(谷氨酸代谢)、“Nucleotide Sugars Metabolism”(核苷酸糖代谢)、“Lactose Synthesis”(乳糖合成)、“Glutathione Metabolism”(谷胱甘肽代谢)、“Pentose Phosphate Pathway”(戊糖磷酸途径)、“Urea Cycle”(尿素循环)、“Starch and Sucrose Metabolism”“Amino Sugar Metabolism”(氨基糖代谢)、“Aspartate Metabolism”(天冬氨酸代谢)、“Galactose Metabolism”(半乳糖代谢)、“Arginine and Proline Metabolism”“Warburg Effect”“Pyrimidine Metabolism”(嘧啶代谢)、“Arachidonic Acid Metabolism” “Tyrosine Metabolism”(酪氨酸代谢)及“Purine Metaboli”等。

4 讨论

本研究通过OPLS-DA分析，从中初步筛选差异代谢物。筛选结果表明，黄芩苷、盐酸小檗碱存在一定的代谢物水平差异，二者存在差别。

L-半胱氨酸是一种存在生物体内具有生理功能的常见的氨基酸，可抗衰老。有研究结果表明，其能有效抑制NADPH氧化酶的活性，提高氧化损伤胚胎的抗氧化能力，利于胚胎发育。因此，推测L-半胱氨酸可能具有提高细菌某种合成反应的活力，进而增强细菌的生存能力[19]。黄芩苷可降低L-半胱氨酸的含量，降低鲍曼不动杆菌的生存活力，进而影响其繁衍增殖。

尿苷三磷酸主要用于RNA合成，也可用作能量来源[20]。RNA是遗传信息的载体，主要包括信使RNA和转运RNA，DNA序列需要转录成RNA，RNA才能被翻译为蛋白质。因此，可以推测在盐酸小檗碱的压力下，鲍曼不动杆菌内的尿苷三磷酸含量发生显著变化，以干扰鲍曼不动杆菌的DNA合成，进而影响其繁衍增殖。

综上所述，本研究利用液相色谱-质谱代谢组学技术，初步探讨了黄芩苷和盐酸小檗碱体外抑制鲍曼不动杆菌的作用机制，筛选出黄芩苷和盐酸小檗碱各9种代谢差异物；进一步将差异代谢物进行代谢通路富集分析，发现黄芩苷与盐酸小檗碱在抑制鲍曼不动杆菌的机制上存在差异。黄芩苷可干扰谷氨酸代谢和半胱氨酸代谢通路等，可下调L-半胱氨酸在谷氨酸代谢通路中的含量；盐酸小檗碱可干扰嘧啶代谢和氨基糖代谢等，可上调尿苷三磷酸在嘧啶代谢通路中的含量。本研究从代谢角度为中药抑制鲍曼不动杆菌提供了参考。

图9 黄芩苷组9种差异代谢物代谢通路富集分析图(附表)Fig 9 Enrichment analysis of 9 differential metabolite metabolic pathways in the baicalin group (attached table)

图中圈内为差异代谢物L-Cysteine(L-半胱氨酸)the differential metabolite L-Cysteine (L-cysteine) is circled in the figure图10 谷氨酸代谢通路图Fig 10 Diagram of glutamate metabolite metabolic pathway

图11 盐酸小檗碱组8种差异代谢物代谢通路富集分析图Fig 11 Enrichment analysis of 8 different metabolite metabolic pathways in the berberine hydrochloride group

图12 盐酸小檗碱组8种差异代谢物代谢通路富集分析图(附表)Fig 12 Enrichment analysis of 8 different metabolite metabolic pathways in the berberine hydrochloride group (attached table)

差异代谢物Uridine triphosphate是图中圈内的磷酸形式the differential metabolite Uridine triphosphate is the phosphate form in the circle in the figure图13 嘧啶代谢通路图Fig 13 Diagram of pyrimidine metabolite metabolic pathway