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基于SRAP分子标记的马铃薯品种遗传多样性分析

2021-09-03姚华开罗英舰郑元利黎礼谦

安徽农业科学 2021年15期
关键词:遗传多样性马铃薯

姚华开 罗英舰 郑元利 黎礼谦

摘要 [目的]研究10个马铃薯品种之间的遗传差异性,了解其亲缘关系。[方法]利用SRAP分子标记技术,共计56对引物组合,对10份马铃薯的DNA进行遗传多样性分析,共筛选出10对背景干净、条带清晰、扩增条带丰富、重复性好的SRAP引物组合进行PCR扩增。[结果]扩增出的96条条带中多态性条带有36条,占比为37.50%。以阈值0.758作为标准,可将马铃薯分为四大类:地泰高原红土豆、云南乌洋芋、威芋3号、云斯特和转心乌;威芋7号和黔芋7号;云南七彩土豆;黑金刚和黑美人。[结论]选用SRAP分子标记技术能较好地区分供试品种之间的亲缘关系,且品种之间的遗传差异性较大,SRAP分子标记技术有助于马铃薯遗传资源的进一步挖掘和利用,对下一步马铃薯改良杂交材料的组配利用和新品种选育具有指导意义。

关键词 马铃薯;SRAP;遗传多样性

中图分类号 S 532  文献标识码 A  文章编号 0517-6611(2021)15-0104-04

Abstract [Objective]In order to study the genetic differences among 10 potato varieties and understand their genetic relationship. [Method]Using SRAP molecular marker technology, a total of 56 primer combinations were used to analyze the genetic diversity of 10 potato DNA samples. Ten pairs of SRAP primer combinations with clean background, clear bands, rich amplification bands and good repeatability were selected for PCR amplification. [Result]Among the 96 bands amplified, 36 were polymorphic, accounting for 37.50%. According to the threshold value of 0.758, potatoes can be divided into four categories: Ditai potato, Yunnan black potato, Weiyu No.3, Yunsite and Zhuanxinwu;Weiyu No.7 and Qianyu No.7;Yunnan colorful potato;Heijingang and Heimeiren. [Conclusion] In this study, SRAP molecular marker technology can better distinguish the genetic relationship between the tested varieties, and the genetic differences between varieties are large. SRAP molecular marker technology is helpful to further mining and utilization of potato genetic resources, and it is helpful for the combination and utilization of potato improved hybrid materials and new variety breeding in the next step.

Key words Potato;SRAP;Genetic diversity

基金項目 贵州省科技计划项目“根类紫色蔬菜种质资源收集、筛选及应用”(黔科技合支撑〔2018〕2332)。

作者简介 姚华开(1993—),男,贵州石阡人,农艺师,硕士,从事蔬菜栽培与育种研究。

*通信作者,农艺师,硕士,从事蔬菜栽培与育种研究。

收稿日期 2021-01-05;修回日期 2021-01-26

马铃薯,又称洋芋、土豆,为一年生具块茎的粮、菜、饲兼用作物[1-2],具有环境适应能力强、单产高、种植成本较低、易种植、耐贮藏等特点,素有“地下苹果”“世界十大营养食品之一”“能源植物”等多项美称[3-4]。

贵州省在明末清初就开始种植马铃薯,历史较为悠久,尤其是近几年种植面积的不断扩大,目前已位列全国三甲[5-7]。马铃薯产业作为贵州省重要的农业产业,在脱贫攻坚和乡村振兴中发挥着举足轻重的作用,近几年随着马铃薯品种更新换代的速度日益加快,对优质、高效、高产马铃薯新品种也提出了更高要求。优良品种的选择是当下马铃薯产业发展面临的一个关键性问题,快速、准确地选择品种是今后推广优质马铃薯品种的主要途径[8]。传统育种过程中对马铃薯品种的鉴别主要采用农艺性状调查和生物形态学统计分析法,但是由于传统方法所需周期较长,且鉴别结果易受人为因素的干扰,导致误差较大。为进一步探索不同马铃薯品种之间的遗传差异性,规范马铃薯管理规程和标准,须对马铃薯品种开展分子标记研究工作,这对今后马铃薯亲本鉴定、品种选育、品种推广都有重要的指导意义[9]。近年来,分子标记技术被广泛用于马铃薯遗传多样性鉴定和育种中,邸宏等[10]和李凤云等[11]采用AFLP和RAPD两种分子标记方法对国内部分马铃薯进行了分子标记和遗传多样性分析;艾星梅等[12]选用12对引物对马铃薯品种“剑川红”开展了自交和杂交群体遗传多样性分析的鉴定;SRAP分子标记技术具有操作简单、效率高、可批量显示标记物、易分离等优点,因此在植物、动物、微生物遗传多样性分析[13]、遗传图谱构建[14]和基因定位[15]等方面都有广泛的应用。

笔者利用SRAP分子标记技术对引进国内育成的马铃薯品种及贵州省本地的10个马铃薯品种进行分析,明确贵州本地马铃薯品种与国内外引进的马铃薯品种之间的遗传多样性,为进一步丰富贵州马铃薯种质资源,同时为挖掘、开发和利用马铃薯优质种质资源,加速育种进程提供科技支撑和理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为块茎马铃薯,供试品种见表1。

1.2 主要试剂及仪器

TaqDNA聚合酶,10×PCR Buffer 缓冲液(含Mg2+),10 mmol/L dNTPs均由Thermo公司生产提供;SARP引物参考相关学者[16-19]已有文献报道,进一步优化开发,上游引物长度为17个碱基,下游引物为18个碱基,上游引物和下游引物通过正交组合成56对引物。引物具体序列见表2。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA提取及检测。

每个品种取50~80 mg块茎加适量液氮研磨成粉末,使用试剂盒提取DNA,试剂盒由天根(北京)有限责任公司提供。各取5 μL DNA溶液用1.0%琼脂糖凝胶进行纯度检测,将符合要求的DNA样品稀释至50 ng/μL,并置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.3.2 SRAP-PCR反应体系及扩增程序。

SRAP-PCR参考王颖等[20]的方法,并对扩增体系进行优化。PCR扩增程序:预变性,94 ℃,1 min,前5个循环;退火,35 ℃,1 min,中35个循环;延伸,72 ℃,1 min,变性,94 ℃,1 min,退火,50 ℃,1 min,后1个循;再延伸,72 ℃,5 min。PCR扩增反应体系:上下游引物,各1.2 μL 5 U/μL TaqDNA 聚合酶,0.15 μL 10×PCR Buffer(mg2+),2.75 μL dNTPs,2.0 μL DNA模板,2.0 μL ddH2O,10.7 μL。

1.3.3 电泳检测预试验。

选用1.8%琼脂糖凝胶扩增产物在110 V/mA电压下进行电泳分离,电泳后用Tanon 1600对凝胶进行拍照,正式试验:扩增产物用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶板上分离,所有胶板存档。

1.3.4 数据统计和分析方法。

从电泳图上挑选出具有差异

性的多态性条带,相同位置上,有条带显示的标记为数字1,无条带显示的标记为数字0,在此基础上组成0和1的原始矩阵,并选用NTSYS-pc 2.1e软件进行聚类分析生成树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 马铃薯品种基因组DNA 的质量检测

对表1中的10个样品进行电泳检测。配制1%琼脂糖胶,取DNA原液5 μL,110 V电泳25 min,电泳检测DNA完整性。从图1可以看出,10个马铃薯品种的DNA电泳条带明晰、亮度好、均匀,表明所提取的DNA质量可以满足SRAP分子标记试验的要求,可用于进行PCR扩增。

2.2 SRAP引物筛选及扩增

每个品种各取1 μL DNA样品作为混合DNA,利用表2中正交组合成的56对引物进行初步筛选,得出如图2所示的结果,初步筛选出10对引物组合。在初筛的基础上,筛选出条带清晰、亮度高、背景干净、条带丰富的10对SRAP引物组合,并用筛选出来的10对SRAP引物组合对10个马铃薯品种进行多态性检测(表3),选取的10对SRAP引物组合共扩增出96个位点条带,其中me6/em2、me7/em2和me3/em5的条带数最多,均为12条;条带最少的引物组合为me3/em3,仅有7条;平均每对引物扩增出的条带数为9.6个。10对引物组合共扩增出亮度高、清晰度好、重复性好的多态性条带36个,其中多态性条带最多的是me1/em8和me5/em5,为5条,最少的是me6/em2,仅为2条,平均为3.6条,多态性占比为37.50%(图2、表3)。

2.3 聚类分析

利用NTSYS-pc2.1数据分析软件计算得到10份供试马铃薯品种两两之间的遗传相似系数(Geneticsimilarity,GS)在 0.740~0.990,平均值为0.865。基于遗传相似系数用类平均法(UPGMA)对选取的马铃薯品种进行聚类分析,结果表明(图 3),当阈值为 0.74时,10份供试材料可分为两大类:第一大类7个品种,分别为0402、0403、0407、0408、0409、0410、0401;其中在阈值为0.77时,又可以进一步分为3个亚类,第一亚类为0402,第二亚类为0403、0407、0408、0490,第三亚类为0401、0410;其中第三亚类的0401和0410的相似系数最高,达0.990,2个马铃薯品种均来自贵州威宁,在外观(薯形、薯皮、芽眼、颜色)极为相似,表明这2个马铃薯品种在亲缘关系上较为接近,遗传差异性较小,第一亚类和第二亚类的0402、0403、0407、0408、0409间亲缘关系比较远。第二大类3个品种为0404、0405、0406;在阈值为0758时,可分为2个亚类,0404独自成一个亚类,0405、0406為第二亚类,其中0405与0406之间的相似性系数为0.950,黑金刚与黑美人在外观与表现上也较为相似,亲缘关系较为接近,二者与第一亚类的0404品种间亲缘关系较远。

3 结论与讨论

SRAP分子标记技术具有操作简单、效率高、可批量显示标记物、易分离等优点,在植物、动物、微生物遗传多样性分分析、遗传图谱构建、QTL定位和基因定位克隆等方面都有广泛的应用,如甜瓜[21]、冰草[22]、国兰[23]、蓝莓[24]、小麦[25]等。

通过聚类分析结果可以较为直观、简洁、清晰地反映出不同马铃薯品种之间亲缘关系的遗传距离,在亲本鉴定、品种选育、品种推广方面都有重要的指导意义,可缩短进程[26]。遗传多样性是研究植物种质资源的重要工作内容之一,全面地掌握现有种质资源的遗传多样性,可以减少育种工作中亲本选配的盲目性,从而提高育种效率[18]。遗传多样性研究最可靠的是基因水平研究,而进行基因测序是最直接、最具说服力的方法,但是对于一个物种或一个种属中每个样品都进行基因组测序的可行性较低。

近年来,RAPD[27]、AFLP[28]、SSR[29]、SRAP[30]等各类分子标记已经在马铃薯种质资源遗传多样性分析中得到了广泛应用。该研究通过选用SRAP分子标记技术对10个不同马铃薯品种进行遗传多样性分析,利用筛选出来的10对SRAP引物组合对10个马铃薯品种进行多态性检测,共扩增出96个条带,所选取的10对扩增引物平均每对引物扩增出的条带数为9.6个。10对扩增引物共扩增出36条多态性条带,平均每对3.6条,多态性占比为37.50%。以阈值0.758为基准,10个马铃薯供试样品可以分为四大类:①0402、0403、0407、0408 和0409;②0401 和0410;③0404;④0405和0406。国内外对马铃薯SRAP分子标记都有相关的研究报道,李丽等[31]对11份贵州马铃薯栽培品种遗传多样性进行SRAP分析,多态性引物比达24%,可将11份品种分为两大类群,聚类分析表明,参试马铃薯品种间的遗传多样性相对丰富,遗传差异较大;程永芳等[17]对宁夏地区54份马铃薯种质资源遗传多样性分析及杂交子代SRAP鉴定,初步判定所有杂种F1均为真实的杂交种,为马铃薯亲本的筛选及杂交子代早期鉴定提供理论数据和技术参考;甘晓燕等[32]利用SRAP分子标记技术对47份马铃薯种质材料进行遗传多样性分析,能够较为全面地描述宁夏地区主要马铃薯品种遗传相似性,SRAP标记更适用于遗传关系较近材料的遗传多样性分析;何凤发等[33]利用SRAP分子标记研究了44份马铃薯种质资源的遗传多样性、亲缘关系和遗传基础,结果表明,表型性状与SRAP标记聚类结果的关联度在块茎品质性状上最大,并系统评价了马铃薯表现型;赵光磊等[34]对黑龙江省主栽34份马铃薯品种遗传多样性进行SRAP分析,多态性比率为49.4%,供试材料可分为3大类7亚类,结果表明黑龙江省主栽马铃薯品种的遗传相似性较高,遗传多样性程度较低;王颖等[20]运用SRAP技术分析10个马铃薯新品系的遗传差异,得到多态性位点条带165个,多态性位点百分率占79.33%,材料间遗传差异相对较大,能准确地将10份马铃薯材料分为4类。

综合分析,该研究的结果与国内外相关学者的研究报道结果一致,采用SRAP分子标记技术能较为准确地区分10个供试马铃薯品种的亲缘关系和遗传差异性,同时辅助采用农艺性状调查和生物形态学统计分析法全面地分析马铃薯品种的遗传多样性和利用好杂交优势,有助于进一步挖掘和利用马铃薯优质的遗传资源,加速育种进程,这对下一步马铃薯改良杂交材料的组配利用和新品种选育有着指导意义。

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