孔玄庆，喻 快，罗泽伟，欧晓明,*，李建明，蒋 煜，郭 军，金晨钟

(1.湖南化工研究院 国家农药创制工程研究中心/湖南省农用化学品重点实验室,湖南 长沙 410014；2.湖南化研院检测技术有限公司,湖南 长沙 410014；3.湖南人文科技学院/农田杂草防控技术与应用协同创新中心，湖南 娄底 417000)

农药作为重要的战略支农物资，在农业生产中起着不可或缺的作用。然而，农田特别是稻田施用的农药不可避免地通过漂移、雨水冲刷、地表径流等多种途径进入水体中,发生一系列的环境化学行为，危及水生生物的安全并通过食物链可危害人类的健康[1-2]。因此,开展农药对水生生物的毒性效应研究，对评价农药对水生生物的危害以及安全合理使用准则的制定具有重要的意义。

斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)是一种广泛存在于我国水体中的淡水单细胞藻类，因其具有对毒物敏感、个体小、实验室易培养、繁殖能力强等特点而在国际上被广泛用于污染物毒性评价[2-4]。双唑草腈(pyraclonil)，化学名称为1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-炔基)氨基]吡唑-4-腈，是德国拜耳公司于1992年研发的一种具吡唑并吡啶环结构的新型除草剂，主要用于稻田防除稗草、牛毛毡、鸭舌草、田皂角、紫水苋菜等多种一年生和多年生杂草，且对作物安全[5-6]。目前国内有关双唑草腈的研究主要集中于合成和应用技术[5-7]，而其对水生生物的生态毒性效应研究报道颇少[8]。基于此，本文在前期工作基础上[8]，以斜生栅藻为试验对象，开展了其对双唑草腈胁迫的响应研究，旨在为双唑草腈对水生生物生态风险评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂与药品 主要仪器：LC-20A型高效液相色谱仪带二极管阵列检测器和化学工作站，UV-1750型紫外可见分光光度计，AUY220型电子天平，XSP-2C-1型生物显微镜，MIKRO 220R型离心机等。

试剂与药品：甲醇(色谱纯)、丙酮(分析纯)和吐温-80；超纯水，由实验室通过Milipore制备：水生4号培养基[9-10]，实验室配制；双唑草腈原药，质量百分数纯度为97.5%。

1.2 供试生物 斜生栅藻引种于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，在温度21～24℃、光照强度4 440～8 880 lx、连续光照的环境条件下振荡培养。

1.3 试验方法

1.3.1 双唑草腈在藻液中的稳定性 为获得更准确可靠的试验结果，参照Hu等[7]建立的方法采用液相色谱法测定了藻液中的双唑草腈浓度变化。分析色谱条件为：色谱柱Inert SustainC18，4.6×150mm(i.d)不锈钢柱，5μm；柱温40℃ ；流动相为甲醇+水=55+45(V/V)；流速为1.00mL/min；进样量为20μL；波长为236nm。在上述色谱条件下，双唑草腈的保留时间为7.80min，采用外标法定量。设置1.00×10-2、5.00×10-2mg a.i./L浓度下2组添加回收试验，每个浓度重复5次，平均添加回收率为97.67%～98.45%，RSD为1.62%～1.82%，说明该方法符合检测分析的基本要求，最低检出量(LOD)为1.00×10-9g，最低检出浓度(LOQ)为1.00×10-2mg a.i./L。

1.3.2 双唑草腈对斜生栅藻的急性毒性 参照《化学农药环境安全评价实验准则》[9]和OECD[10]推荐的生长抑制法。在预试验基础上，设定试验浓度分别为1.00×10-2、1.20×10-2、1.44×10-2、1.73×10-2、2.07×10-2、2.49×10-2mg a.i./L。在无菌条件下将双唑草腈先用水生4号培养基溶液溶解、超声、定容，分别得到两倍上述浓度药液50mL，再分别加入50mL浓度为 2.00×104cell/mL的藻液，振荡混合均匀后于恒温光照培养箱中培养，每天摇荡3～5次，每个浓度设3次重复，并设空白对照组。于0、24、48、72h时取样在显微镜下采用血球计数板测定各处理藻细胞数，并观察其中毒症状，分别计算出藻细胞生物量半效应浓度(EyC50)和藻细胞生长率半效应浓度(ErC50)。

1.3.3 双唑草腈对斜生栅藻光合色素的影响 参照熊丽等[11]和欧晓明等[12]的方法，并稍改进。藻类培养液经双唑草腈暴露处理72h后，用移液管吸取藻细胞液30mL，4 000r/min离心10min，倾出上清液，直接加入5mL 80%(V/V)丙酮水溶液，摇匀，然后在光照培养箱中黑暗抽提12h，4 000r/min离心10min，取上清液于石英比色皿中，以80%丙酮溶液作为参比，用紫外可见分光光度仪分别测定藻细胞液在663nm、645nm和440nm波长下的吸光值，并按照公式(1)、(2)和(3)分别求出藻细胞叶绿素a(Ca)、叶绿素b(Cb)和类胡萝卜素(Ck)含量(mg/L)。

Ca=12.7OD663-2.69OD645

(1)

Cb=22.9OD645-4.68OD663

(2)

Ck=4.70OD440-0.27(Ca+Cb)

(3)

1.4 统计方法 所有试验数据均采用SPSS16.0软件进行整理和分析，以浓度的对数值作为自变量(x)，斜生栅藻的抑制率作为因变量(y)，建立剂量-效应线性关系方程、计算EC50和95%置信区间；使用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析数据的显著性，采用duncan检验对数据进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 双唑草腈在藻液中的稳定性 试验期间各处理组藻细胞溶液中双唑草腈的实测浓度(表1)。空白对照组中未检测出双唑草腈，在暴露处理72h时藻细胞培养液中的双唑草腈浓度为0h时的81.14～96.2%，偏差未超过20%，试验结果以0h和72h实测浓度的几何平均值计[9-10]。

表1 试验起始和结束时双唑草腈在溶液中的浓度变化

2.2 双唑草腈对斜生栅藻的急性毒性 试验期间，与空白对照组相比，藻细胞溶液颜色随双唑草腈暴露处理时间延长而变浅变黄，高浓度组尤为明显，说明双唑草腈对藻细胞的生长具有不同程度的抑制作用，且该抑制作用与药剂浓度呈现出明显的相关性(图1)。72h时，空白对照组中藻细胞浓度为1.38×106±3.06×104cell/mL。从藻细胞生物量分析，双唑草腈对藻细胞生物量的抑制作用随暴露浓度升高和时间延长而增强，当暴露时间为72h时，各处理间抑制率差异显著(p<0.05)，其对藻细胞生物量的抑制作用达到最强，2.49×10-2mg a.i./L处理浓度组的生物量抑制率达到了90.79%(p<0.05)。从藻细胞生长率分析，72h时各处理间抑制率差异显著(p<0.05)，但双唑草腈对藻细胞生长率的抑制作用表现出与藻细胞生物量不同的现象，在暴露时间相同时，双唑草腈对藻细胞生长率的抑制呈现随浓度增大而增强的变化趋势，而处理浓度相同时，双唑草腈对藻细胞生长率的抑制作用随时间延长并没有表现出明显的规律性变化。

图中小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同图1 双唑草腈对斜生栅藻生长的抑制动态

根据生物量抑制率和生长抑制率数据，采用SPSS16.0统计分析软件进行线性回归分析，并求得双唑草腈对藻细胞生物量或生长的EyC50或ErC50值，结果列于(表2)。除草剂双唑草腈对斜生栅藻生长的抑制作用随着时间推移而逐渐增强，表现出良好的线性相关性，且相同暴露时间时双唑草腈对斜生栅藻生物量的抑制作用强于对生长率的抑制。暴露时间为24、48和72h时，以生物量为指标，双唑草腈对斜生栅藻的EyC50值分别为2.07×10-2mg a.i./L、1.50×10-2mg a.i./L和1.38×10-2mg a.i./L，而以生长率为指标，ErC50值分别为2.60×10-2mg a.i./L、2.45×10-2mg a.i./L和2.41×10-2mg a.i./L。

表2 双唑草腈对斜生栅藻的急性毒性

2.3 双唑草腈对斜生栅藻光合色素的影响 用不同系列浓度的双唑草腈药液处理斜生栅藻，经暴露72h，取样测定藻细胞中叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量，结果(图2)和(表3)。可见，双唑草腈对斜生栅藻光合色素的影响因光合色素种类而异。随着双唑草腈浓度的升高，藻细胞中叶绿素a、叶绿素b含量及其比值Ca/Cb均表现出不同程度的下降趋势，其中对叶绿素a的影响具有显著差异(p<0.05)，当双唑草腈的浓度为2.49×10-2mg a.i./L时，叶绿素a和叶绿素b受到的抑制作用最大，其抑制率分别为71.78%(p<0.05)和45.60%(p<0.05)，然而双唑草腈对藻细胞中类胡萝卜素的影响较小。说明双唑草腈严重影响了斜生栅藻的光合作用，从而抑制了叶绿素a 和叶绿素b的生成，尤其是在叶绿素a值的变化更能很好地体现双唑草腈的毒性抑制作用。

图2 双唑草腈对斜生栅藻光合色素的影响

表3 72h时双唑草腈对光合色素的抑制动态

以双唑草腈实测浓度的几何平均值浓度对数为横坐标(X)及其对叶绿素a、叶绿素b的抑制率为纵坐标(Y)进行线性回归拟合，结果表明双唑草腈与叶绿素a、叶绿素b之间均表现出明显的浓度-效应关系。双唑草腈对叶绿素a的抑制率的线性方程为Y=3.93x+6.98，R2=0.979，双唑草腈对叶绿素a的72h-IC50为1.68×10-2mg a.i./L，95%置信区间为1.58×10-2～1.81×10-2mg a.i./L；双唑草腈对叶绿素b的抑制率的线性方程为Y=2.14x+3.50，R2=0.923，双唑草腈对叶绿素b的72h-IC50为2.33×10-2mg a.i./L，95%置信区间为1.99×10-2～3.18×10-2mg a.i./L。可见，双唑草腈对叶绿素a的抑制作用要强于对叶绿素b的抑制作用。

3 结论与讨论

农药对藻类的毒性效应主要由农药的化学结构和理化性质决定，不同农药对藻类的毒性效应不同，并在很大程度上表现为浓度相关性[3,12]。本研究表明不同浓度的双唑草腈溶液中斜生栅藻生物量和藻细胞生长受到程度不同的抑制作用，且生长速率均低于空白组，同时双唑草腈高浓度处理组(2.07×10-2、2.49×10-2mg a.i./L)还出现部分藻细胞体积增大、子细胞畸形分裂、人字形和裤型，2.49×10-2mg a.i./L处理中出现藻液脱色变黄等现象，这与前人报道的除草剂对藻类毒性效应的研究结果一致[2,12-16]。本试验研究证实，以藻细胞生物量和生长率为指标，参照《化学农药环境安全评价试验准则》和OECD农药对藻类的毒性分级标准[9-10]，双唑草腈对斜生栅藻均表现为高毒。因此，在农业生产中，必须科学合理使用双唑草腈除草剂，注意施药方法和施药量的控制，尽量避免其进入水体，减少对水生生态环境的污染。

叶绿素是各种浮游藻类中广泛存在的天然色素，其中叶绿素a存在于所有的浮游藻类中，大约占有机物干重的 1%～2%，是估算浮游植物生物量的重要指标[2,17]，同时叶绿素含量也是客观反映植物利用光照能力的一种重要指标，往往作为判断植物光合能力强弱，反映环境胁迫状况的依据[2-3,12,16]。本研究证实双唑草腈对斜生栅藻叶绿素a和叶绿素b具有明显的抑制作用，其对叶绿素a的抑制作用明显强于对叶绿素b的抑制作用，且叶绿素a与叶绿素b的比值随着处理浓度升高而变小。在正常的细胞中，叶绿素a与叶绿素b的比值会维持在一个稳定的水平，比值减小对植物的光合作用影响较大[18]，这应该与双唑草腈的作用方式有关，双唑草腈作为一种触杀型双吡唑类除草剂，其通过植物组织中原卟啉原氧化酶积聚而发挥药效[5]。原卟啉原氧化酶与细胞中叶绿素和血红素的合成有关，当此酶受到抑制后，便会导致叶绿素第一个吸收光的前体物质原卟啉原IX的积累[19]，进入细胞质后被氧化成原卟啉IX，进一步代谢产生单线态氧，造成细胞膜等过氧化，破坏细胞结构，影响叶绿素的合成和光合作用受阻[20]，导致藻细胞的生长受到抑制。因此，作者认为叶绿素a不仅可以作为评价藻类生物量的重要指标，还可作为藻类对农药等污染物敏感性强弱的毒性评价指标。