李 清，瞿发林*，陈 颖，董文燊，郭宜银，汪慧贤

(1.联勤保障部队第九〇四医院药剂科，江苏常州 213003；2.南京中医药大学翰林学院药学院，江苏泰州225300)

睡眠是人类日常生活必不可少的一种生理需求。然而，由于生活节奏加快和生活压力增大，失眠成了现代社会常见的一种疾病，成为影响人类健康的重要问题之一。失眠症是以长期入睡困难或睡眠持续困难并导致睡眠质量下降为主要特征的疾病。研究表明，中国成年人失眠率高达38.2%[1]。目前，治疗失眠的药物仍以化学合成类药物为主，长期服用会产生成瘾性、耐药性等毒副作用。因此，越来越多的研究者致力于中药镇静催眠作用的研究，以发现疗效好、安全性高的中药材。

豨莶草为菊科豨莶属草本植物，又名“肥猪苗”、“黏糊菜”、“风湿草”等，其基源植物包括豨莶(SiegesbeckiaorientalisL.)、腺梗豨莶(S.pubescensMakino)、毛梗豨莶(S.glabrescensMakino)，广泛分布于全国各地，以地上部分入药，具有祛风湿、通经络、清热解毒的功能，可用于治疗半身不遂、风疹湿疮、风湿痹痛、虫兽咬伤、筋骨不利、腰膝无力[2]。本课题组前期走访发现，在我国某些地区，农民用豨莶草喂猪，猪在食用豨莶草后能促进睡眠，减少活动时间，从而体重不断上升。本课题组前期研究发现，豨莶草提取物具有明显的镇静催眠活性[3]，为了进一步研究其活性部位，本文研究了豨莶草提取物不同萃取部位的镇静催眠作用。

1 材 料

1.1 实验动物 100只SPF级ICR小鼠，雄性，体重为(20±2) g[江苏省常州市卡文斯实验动物有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK(苏)2016-0010]。小鼠在温度(25±2) ℃、湿度(55±10)%、干净整洁的环境中适应性饲养7 d，自由摄取饮用水和标准饲料，保持昼夜正常节律。

1.2 药材和试剂 豨莶草提取物(本课题组前期研究所得)；戊巴比妥钠(Sigma公司，批号191201)；艾司唑仑片(常州四药制药有限公司，批号20200111)；生理盐水(四川美大康佳乐药业，批号20010321)。石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等均为分析纯。

1.3 仪器和设备 XS105型电子分析天平(梅特勒托利多仪器有限公司)；FQ-1006HTD型超声波清洗仪(杭州法兰特超声波科技有限公司)；电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)； RE-5C式旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂)；CT-C-O型烘箱(常州市范氏干燥设备有限公司)；自制开野实验敞箱(50 cm×50 cm×30 cm)，箱内色调均为黑色，箱底用白线画出25个同等面积的方格。

2 方 法

2.1 豨莶草提取物各萃取部位的制备 取适量豨莶草干燥提取物，粉碎，用水溶解后，得到豨莶草提取物混悬液。按照极性由小到大的顺序，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进行液液萃取，萃取液减压浓缩干燥，得到各萃取部位。石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各部位萃取率分别为5%、10%、10%和20%。

2.2 动物分组和给药方案 将100只小鼠随机分成10组：空白对照组，艾司唑仑组(0.8 mg/kg)，石油醚萃取部位低、高剂量组(40、80 mg/kg)，二氯甲烷萃取部位低、高剂量组(80、160 mg/kg)，乙酸乙酯萃取部位低、高剂量组(80、160 mg/kg)，正丁醇萃取部位低、高剂量组(160、320 mg/kg)，每组10只。每天下午17：00灌胃给药，连续灌胃8 d。

2.3 小鼠自主活动的测定 在第6天给药30 min后，保持环境安静、无嘈杂，将小鼠放置在开野实验敞箱中适应1 min，待适应时间结束后，观察小鼠在5 min内的自主活动，记录其活动次数。小鼠的自主活动包括：舔爪、清洗整理身体、擦脸均可记为清洗身体1次；小鼠四肢全部进入1个方格记为水平走格1次；小鼠前肢攀附箱壁或离箱底站立记为站立1次。每只小鼠观察结束后，需清理敞箱，以免对下一只小鼠造成不必要的干扰。

2.4 豨莶草提取物各萃取部位与阈上剂量戊巴比妥钠协同作用的研究 基于前期研究戊巴比妥钠剂量的预实验，选定腹腔注射戊巴比妥钠溶液的阈上剂量为41 mg/kg。在第7天给药40 min后，给小鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液41 mg/kg，注射后立刻计时，观察并记录小鼠的入睡潜伏期和睡眠时长。入睡潜伏期是指小鼠从注射戊巴比妥钠至翻正反射消失的时间，睡眠时长是指小鼠从翻正反射消失至翻正反射恢复的时间[4-6]。

2.5 豨莶草提取物各萃取部位与阈下剂量戊巴比妥钠协同作用的研究 基于前期研究戊巴比妥钠剂量的预实验，选定腹腔注射戊巴比妥钠溶液的阈下剂量为35 mg/kg。在第8天给药40 min后，给小鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液35 mg/kg，观察小鼠在15 min内的睡眠情况。若小鼠翻正反射消失且持续1 min以上，则认为其进入睡眠状态，根据睡眠小鼠数量，计算入睡率。入睡率(%)=(进入睡眠小鼠数量/小鼠总数量)×100%[7]。

3 结 果

3.1 豨莶草提取物各萃取部位对小鼠自主活动的影响 各组小鼠自主活动次数测定结果见表1。与空白对照组相比，艾司唑仑组(P<0.05)、 石油醚萃取部位高剂量组(P<0.001)、二氯甲烷萃取部位高剂量组(P<0.05)、乙酸乙酯萃取部位低剂量组(P<0.05)、乙酸乙酯萃取部位高剂量组(P<0.05)小鼠的自主活动次数均显著降低。由此可见，高剂量石油醚萃取部位，高剂量二氯甲烷萃取部位，低、高剂量乙酸乙酯萃取部位对小鼠均具有明显的镇静作用。

表1 豨莶草提取物不同萃取部位对小鼠自主活动、睡眠时长、入睡潜伏期和入睡率的影响

3.2 豨莶草提取物不同萃取部位对阈上剂量戊巴比妥钠镇静催眠作用的影响 协同阈上剂量的戊巴比妥钠时，各组小鼠的睡眠时长和入睡潜伏期测定结果见表1。与空白对照组相比，艾司唑仑组(P<0.01)、二氯甲烷萃取部位高剂量组(P<0.05)、乙酸乙酯萃取部位高剂量组(P<0.001)小鼠的睡眠时长均显著增加；艾司唑仑组(P<0.05)、二氯甲烷萃取部位高剂量组(P<0.05)、乙酸乙酯萃取部位高剂量组(P<0.01)小鼠的入睡潜伏期显著缩短。结果表明，高剂量二氯甲烷萃取部位和高剂量乙酸乙酯萃取部位具有明显的镇静催眠作用。

3.3 豨莶草提取物不同萃取部位对阈下剂量戊巴比妥钠镇静催眠作用的影响 协同阈下剂量的戊巴比妥钠时，各组小鼠的入睡率见表1。与空白对照组相比，艾司唑仑组(P<0.05)、二氯甲烷萃取部位低剂量组(P<0.01)、二氯甲烷萃取部位高剂量组(P<0.01)、乙酸乙酯萃取部位高剂量组(P<0.001)小鼠的入睡率显著提高，结果表明低、高剂量二氯甲烷萃取部位和高剂量乙酸乙酯萃取部位具有明显的镇静催眠作用。

4 讨 论

豨莶草味辛、苦，性寒，归肝、肾经。曾有报道称，由于豨莶草味苦、寒，入肝、肾经，通过清肝肾郁热，起到镇静安神的作用，可治疗顽固性失眠[8]。本课题组的前期研究发现，豨莶草提取物具有明显的镇静催眠作用，为了进一步深入研究其镇静催眠作用的物质基础，本文建立了开野实验，阈上剂量、阈下剂量戊巴比妥钠协同作用实验等对豨莶草的镇静催眠活性部位进行了筛选。开野实验考察了药物对小鼠自主活动的影响，从而反映出豨莶草提取物是否具有镇静作用，而阈上和阈下剂量戊巴比妥钠协同睡眠实验则以睡眠潜伏期、睡眠持续时间和入睡率等指标来评价小鼠的睡眠情况，从而反映豨莶草提取物在体内的镇静催眠活性。结果表明，豨莶草石油醚萃取部位高剂量组、二氯甲烷萃取部位高剂量组、乙酸乙酯萃取部位低、高剂量组小鼠的自主活动次数均显著降低；二氯甲烷萃取部位高剂量组、乙酸乙酯萃取部位高剂量组小鼠的睡眠时间均显著延长，并且入睡潜伏期缩短；二氯甲烷萃取部位低、高剂量组，乙酸乙酯萃取部位高剂量组小鼠的入睡率均显著增加，这表明二氯甲烷萃取部位和乙酸乙酯萃取部位具有显著的镇静催眠作用，是豨莶草发挥镇静催眠作用的活性部位。此外，豨莶草石油醚萃取部位能显著减少小鼠的自主活动次数，但对入睡率、入睡潜伏期和睡眠时长没有影响，这表明豨莶草的石油醚萃取部位可能仅具有镇静作用，并无催眠作用。通过查阅大量文献，作者根据化合物的极性推测，豨莶草中的萜类化合物如二萜类和倍半萜类化合物[9]多分布于二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位中。因此， 二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位发挥镇静催眠作用的物质基础是否与萜类化合物有关，值得进一步深入研究。本研究为探索豨莶草提取物中的镇静催眠活性化合物奠定了基础。