严庭发 兰淑惠 丁野 徐林

(1定安龙湖南科食用菌有限公司海南定安 571200;2中国检验认证集团广西有限公司广西南宁 530000;3中国热带农业科学院环境与植物研究所海南海口 571101;4海南省热带生态循环农业重点实验室海南海口 571101)

灵芝是担子菌门（Hymenomyeetes）伞菌纲（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporace）、灵芝 科（Ganodermataceae）灵芝属（Ganoderma）真菌［1］。在中国传统文化中，灵芝自古以来就被视为一种珍贵药材，俗称“瑞草”“灵芝草”“万年蕈”等。在中国最古老的药典《神农本草经》中，灵芝被列为上等药品，有“帝王之药”之称［2］。灵芝之所以备受推崇经久不衰，得益于其可食可补可药的强大功效。临床试验证明，灵芝具有提高机体免疫力、抗肿瘤、保肝护肝、降血糖、改善人体睡眠质量等功能［3-6］。灵芝的有效成分有数十种之多，包括多糖类、三萜类、腺苷类、生物碱类、多肽氨基酸类等［7］，其中多糖类和三萜类化合物与其药理活性密切相关，是灵芝的主要活性成分［8-10］，且灵芝的三萜含量及种类已成为评价灵芝品质的重要指标。

海南省位于中国南部，属热带季风气候区，整个岛屿全年气候温和，雨量充沛，得天独厚的自然条件极为适合灵芝生长。灵芝在中国分布范围广泛，多分布于南方，以海南的种类最为丰富，其中不乏海南特色灵芝，如喜热灵芝［11］等。近年来，灵芝的药用价值在民间受到越来越多的重视，弯柄灵芝（Ganoderma flexipes）、黑灵芝（Ganoderma atrum）、无柄紫灵芝（Ganoderma mastoporum）等品种在海南民间都可作为灵芝（Ganoderma lingzhi）的代替品种使用，且售价颇高，导致海南地区灵芝的野生资源急剧减少［12］。由此可见，海南灵芝市场需求及其特有野生资源的保护都不能忽视。本研究对收集到的12个灵芝菌株进行引种及生理特性和三萜成分分析，以期为海南灵芝栽培及选育和特有野生灵芝资源的保育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试灵芝菌株共12个，具体信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 灵芝菌株菌丝体生理特性分析

灵芝菌丝体的复壮及扩繁使用马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂粉20 g/L、自然pH，以121℃灭菌20 min后备用。

温度试验培养基（CPDA）：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂粉20 g/L、硫酸镁1.5 g/L、磷酸二氢钾3 g/L、自然pH，121℃灭菌20 min后备用。

碳源试验培养基：马铃薯200 g/L、供试碳源（葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、D-果糖、糊精）20 g/L、琼脂粉20 g/L、硫酸镁1.5 g/L、磷酸二氢钾3 g/L、自然pH，121℃灭菌20 min后备用。

氮源试验培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、供试氮源（蛋白胨、麦麸、尿素、牛肉膏）3 g/L、琼脂粉20 g/L、硫酸镁1.5 g/L、磷酸二氢钾3 g/L、自然pH，121℃灭菌20 min后备用。

表1 参试灵芝菌株信息

pH试验培养基：马铃薯葡萄糖分别为200、20 g/L、琼脂粉20 g/L、硫酸镁1.5 g/L、磷酸二氢钾3 g/L，H2SO4（1 mol/L）、NaOH（1 mol/L），分别调节培养基pH 5、6、7、8、9，以121℃灭菌20 min后备用。

采用平板划线法，每隔24 h标记一次菌落直径，观察菌落颜色和气生菌丝密度，至任一菌株长满平板后测量菌落直径，计算菌丝生长速度（平均菌落直径/菌丝生长天数）。每处理3个重复，除不同温度梯度实验外均以25℃培养。

1.2.2 灵芝菌株出菇情况测试

母种培养基为CPDA培养基，以121℃灭菌20 min后备用。

原种培养基配方为：棉籽壳84%，麸皮15%，石膏1%。栽培料配方为：棉籽壳40%，麦麸10%，木屑47%，3%熟石灰。上述培养基在121℃灭菌150 min后备用。

将接种后的菌包置于海南省定安县的大棚内进行培养，发菌期间环境温度控制在25℃左右，出菇时温度自然，环境湿度控制在65%～85%，观察是否可以正常出菇及出菇形态。

1.2.3 不同灵芝菌株品种鉴定

采用ITS序列分析法对不同灵芝菌株进行品种鉴定［13］。方法如下：使用百泰克真菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取灵芝基因组DNA，选用2条特异引物ITS1（5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（5’TCCTCCGCTTATTGATATGC）对各灵芝菌株基因组DNA进行聚合酶链式反应（PCR）；通过琼脂糖凝胶电泳检测到目的扩增片段后，将PCR扩增产物送往华大基因测序；得到各灵芝菌株ITS序列后，用BLAST工具进行同源序列比对，使用统计软件MegaX构建系统发育树。

1.2.4 不同灵芝菌株子实体总三萜含量测定分析

1.2.4.1 标准曲线绘制

精密称取适量齐墩果酸对照品粉末，用甲醇溶解，制成0.2 mg/mL的对照品溶液；分别精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL置于15 mL具塞试管；将试管置于真空冷冻干燥机内并将液体抽干；精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密称取香草醛0.5 g，用冰醋酸溶解成10 mL的溶液即得）0.2 mL，高氯酸0.8 mL，充分摇匀；于70℃水浴15 min；取出后立即冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL；各试管临测定前摇匀，以相应试剂为空白对照，在546 nm波长处测定吸光度；以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.4.2 总三萜提取及检测

（1）提取将真空冷冻干燥后的子实体研磨成粉末，精密称取1 g粉末置于50 mL离心管中，加入25 mL乙醇，以超声功率100 W处理55 min；过滤，滤液置于50 mL容量瓶中，共提取2次；用乙醇分次洗涤滤器和滤渣，将洗液放入同一容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，备用。

（2）检测精密量取上述总三萜溶液0.2 mL，置于15 mL具塞试管中，将试管置于真空冷冻干燥机内并抽干液体，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，充分摇匀，以70℃水浴15 min；取出后立即冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL，各试管临测定前摇匀；以相应试剂为空白对照，在546 nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出三萜溶液中齐墩果酸的含量，计算即得样品中三萜含量。

1.2.5 不同灵芝菌株子实体三萜类化合物指纹图谱分析

总三萜提取及测定方法参考专利“一种灵芝中17种三萜化合物含量的检测方法”（专利号：CN 108181396 A）所描述的方法进行［14］，具体方案如下：将灵芝子实体研磨成粉末状，加入乙酸乙酯（料液比为1∶20，m∶V），以60℃加热超声提取30 min后离心收集上清，将上清抽滤冻干后获得浓缩物；使用色谱级甲醇将浓缩物复溶（料液比为1∶1，m∶V），用0.22µm孔径有机相微孔滤膜将复溶液过滤；采用高效液相色谱法测定灵芝三萜类化合物指纹图谱，流速为1.0 mL/min，检测波长为252 nm，进样量为10µL，柱温为25℃，流动相系统为乙腈-水（含有0.01%冰醋酸），梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 灵芝菌株品种鉴定结果

将获得的ITS序列与NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）核酸数据库进行比对（图1），其中供试菌株A、B、K、C、I、H、F与Gano‐derma lingzhi聚为一支；供试菌株E、G与无柄灵芝属（Ganoderma sessile）聚为一支；供试菌株D与紫芝（Ganoderma sinense）聚为一支；供试菌株J与新日本灵芝（Ganoderma neojaponicum）聚为一支；供试菌株L与有柄树舌（Ganodermagibbosum）聚为一支。

图1 基于ITS序列的菌株间系统发育树

2.2 不同灵芝菌株菌丝体生理特性

综合评估菌丝体在平板上的生长速度、菌落形态及菌丝体疏密程度，筛选得到各灵芝菌株的最适碳源、最适氮源及最适pH值，如表3所示（p＜0.05）。

表3 各灵芝菌株的最适碳氮源和pH值

由表3可知，不同灵芝菌株的生长条件略有不同，蔗糖为供试灵芝菌株生长的最适碳源；麦麸或牛肉膏均可作为供试灵芝菌株生长的氮源，其中麦麸较为普试；供试灵芝菌株为中高温型菌株，25～30℃较适合灵芝菌丝体生长；pH 5～7时，供试灵芝菌株菌丝体长势较好，表明中性偏酸性的环境较适合供试灵芝菌丝体的生长。

2.3 不同灵芝菌株出菇测试结果

共栽培12个不同灵芝菌株，其中6个菌株可在海南省定安县正常出菇，出菇形态如图2所示。菌株K形状圆润，菌盖表层集聚了喷射的孢子粉，去除孢子粉后表面光滑；菌株F可形成层状菌盖；菌株I分支较多，菌柄细长，无菌盖，状如珊瑚；菌株H菌盖为圆形，较圆润；菌株J菌柄细长，菌盖偏生且较小。

图2 供试品种子实体情况

2.4 不同灵芝菌株子实体总三萜比例分析结果

6种待测样品的总三萜比例都高于中国药典（2020版）要求的0.5%，其中菌株F子实体总三萜比例最高，达到1.44%（图3）；菌株G与菌株J总三萜比例较低，分别为0.99%和0.92%。

图3 供试品种子实体总三萜比例

2.5 不同灵芝菌株子实体三萜类化合物色谱图谱分析结果

采用高效液相色谱法分析灵芝菌株F、G、H、I、J、K子实体三萜类化合物，得到各灵芝子实体色谱指纹图谱，如图4所示。除菌株J基线不稳、后期较高外，其余各灵芝三萜类化合物液相色谱图基线较好。各色谱峰分离也较好，满足后续分析要求。由三萜化合物指纹图谱（表4）相似度可知，菌株H、K、G所含有的三萜化合物相似度较高，菌株J、F所含有的三萜化合物相似度较高，菌株I所含有的三萜类化合物与其它菌株均有较大差异。

表4 各供试灵芝菌株间三萜化合物指纹图谱相似度

图4 灵芝子实体指纹图谱

3 讨论与结论

3.1 讨论

海南独特的热区生境适宜开展灵芝生产栽培。适宜海南栽培的品种对海南灵芝产业发展起关键作用。根据灵芝产品用途主要分为观赏和药用两大类型。观赏灵芝主要关注子实体性状，通常造型奇特的子实体更具观赏性。由于审美的差异性，人们对灵芝造型的喜好各有不同，本研究筛选到的珊瑚灵芝（I）形态与其他灵芝具有较大差异，且无需高二氧化碳环境诱导，具有一定的便捷特点。此外，观赏灵芝可采用基于加定型模具的生长期控制法和弯曲、分割、固定、嫁接、插接、靠接等后期造型控制措施［15］来实现。药用是灵芝的主要用途。随着国家食药监局对灵芝既是食品又是药品试点工作的推进，灵芝产业将进一步扩大，对栽培灵芝的需求将越来越大。灵芝三萜类化合物作为灵芝的主要活性物质［16］，因具有保肝护肝、抗高血压、抗HIV-1活性、抗氧化、抗肿瘤等作用［8，17］而一直备受关注。目前从灵芝中分离得到的三萜类化合物已达300多种［18］。有研究表明，不同品种灵芝的三萜种类和含量存在差异，而黑芝几乎不含三萜类有效成分［19］。作为一种药用原料，当开发生产倾向于保肝护肝作用的药物或保健品等时，应选择三萜类含量较高的灵芝菌株［20］。本研究显示，盆景灵芝（F）三萜类化合物达到1.44%、南韩灵芝（H）达到1.41%，可作为海南灵芝栽培的优质菌株。

此外，以弯柄灵芝为代表的特色灵芝资源是海南优势资源，应加强该类灵芝资源的保护利用。弯柄灵芝是一类主要分布于热带区域、子实体菌柄细长、菌盖较小的灵芝，因其药用价值高，深受消费者喜爱，市场售价逐年增高。目前，该类灵芝的民间名称还不统一，有待进一步规范。本研究中弯柄灵芝菌株（J）分离于竹子根部，根据形态特征和生境特点，民间命名为竹灵芝；但ITS序列比对分析表明，其与Ganoderma neojaponi‐cum序列的相似度为100%；而Cao等［1］利用形态学及分子生物学方法证实黑芝（Ganoderma atrumJ.D.Zhao 1979）、喜热灵芝（Ganoderma cali‐dophilumJ.D.Zhao 1979）、海南灵芝（Gano‐derma hainanenseJ.D.Zhao 1979）、小马蹄灵芝（Ganoderma parviungulatumJ.D.Zhao & X.Q.Zhang 1986）是Ganoderma flexipes的 同 物 异名［1］，因此菌株J实际上应为Ganoderma flexi‐pes，中文名为弯柄灵芝。

3.2 结论

灵芝（K）、盆景灵芝（F）、盆景灵芝3号（G）、珊瑚灵芝（I）、南韩灵芝（H）、弯柄灵芝（J）可根据需求在海南地区栽培。盆景灵芝（F）、南韩灵芝（H）更适合于对总三萜含量要求高的灵芝生产，而珊瑚灵芝（I）更适合用于制作盆景灵芝。开展栽培时，种植户可根据各品种最适的培养条件，培养平板菌种或液体菌种。蔗糖、麦麸或牛肉膏可作为通用性菌种培养基配方。