柯尝玲，付戴波，陈桂平，张串联，邹雨妃，曹远东

（1.九江市农业科学院，江西九江 332000；2.九江市畜牧兽医局，江西九江 332000，3.江西省养蜂研究所，江西南昌 330000，4.江西嘉博生物工程有限公司，江西都昌 332600）

蜜蜂蜂房球菌引起的烂子病是我省中蜂养殖的主要病害之一，每年春秋蜜蜂繁殖季节频发，给中蜂养殖带来很大的损失[1]。长期使用抗生素后，治疗效果越来越差。中药在替代抗生素方面具有天然的优势。基于此，试图通过体外抑菌敏感试验，从10 味常见常用药材中筛选出对蜂房球菌高效敏感的药物，为开发新药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药材

黄芩、黄连、马齿苋、金银花、蒲公英、地锦草、栀子、车前草、板蓝根、大青叶，均由江西嘉博生物工程公司提供，所有药材均符合生药质量标准。

1.1.2 培养基

蛋白胨1 g、半胱氨酸0.02 g、葡萄糖0.5 g、果糖0.5 g、可溶性淀粉1 g，加纯化水至100 ml（用1 mol/L KH2PO4调pH 至6.6）；固体培养基按以上成分比例，增加琼脂2 g。

1.1.3 菌株

蜜蜂蜂房球菌2 株，从我省中蜂养殖场病料中分离出的优势菌株（BCDwn 株、BCDrj 株）。

1.2 方法

1.2.1 中药原液的制备

参照文献方法[1]将上述药材分别称取100 g，加入3 倍的纯化水，浸泡1 h，加热至沸腾后用文火维持煎煮30 min，始终保持3 倍量水，用4 层纱布过滤，滤渣加2 倍水再煎煮30 min。合并两次滤液，减压浓缩至100 ml，配成100%原药液（每ml相当于1 g 生药），将所得原药液用1 000 r/min离心10 min，取上清液作为供试液，灭菌，冷却后，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 菌液的制备

经斜面培养复壮2 次后，挑取一环斜面菌种，接种至液体培养基，在加10%CO2的厌氧条件下，34℃～35℃培养24 h；用无菌生理盐水稀释成菌悬液，使活菌数为1×106CFU/ml，备用。

1.2.3 抑菌圈的测定

采用平皿挖孔法，参照文献方法[2～3]。吸取配制好的菌液100 μl 均匀涂布于4 mm 厚的固体培养基上，然后打孔，每孔加目的浓度的受试药液50 μl，于加10%CO2的厌氧条件35℃培养24 ～48 h，观察结果，测量抑菌圈直径（mm）。对抑菌结果进行判定，抑菌圈直径＞20 mm 为极度敏感，抑菌圈直径15 ～20 mm 为高度敏感，抑菌圈直径10 ～15 mm为中度敏感，抑菌圈直径＜10 mm 为轻度敏感，无抑菌圈为不敏感或耐药。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定

采用试管二倍稀释法[4]测定各药材对供试菌的MIC。取灭菌具棉塞试管11 支，编号，每管先加入与试验菌种对应的液体培养基2 ml；然后于第1 管中加入灭菌的受试药液2 ml，混匀后取出2 ml 放入第2 管中，依次梯度稀释，直至第9 管取出2 ml 弃去；第10 管不加药液，作为菌液阳性对照（该管应有细菌生长）；第11 管加受试药液2 ml，混匀后取出2 ml 弃去，不加细菌，作为药液阴性对照（该管应无细菌生长）；取细菌稀释液0.1 ml，分别加入上述1 ～10 管中混匀，11 号管加0.1 ml 灭菌生理盐水，然后各管置于加10%CO2的厌氧条件下，35℃培养24 h，观察结果。培养基混浊，表示有细菌生长；培养基完全清亮，表示无细菌生长。以抑制试验菌生长的药液最高稀释度为该药材对该试验菌的抗菌效价，即以能抑制试验菌生长的最高稀释度为MIC。

1.2.5 最低杀菌浓度（MBC）的测定

挑取一环MIC 终点浓度以上未生长细菌的各稀释管内培养物，划线于与菌种对应的固体培养基上，于加10%CO2的厌氧条件下，35℃培养24 h，观察有无细菌生长。培养基中无细菌生长的最低浓度即为该药液的最低杀菌浓度。

2 结果与分析

2.1 不同药材的抑菌直径

黄芩等10 味药材对两株临床分离蜂房球菌的体外抑菌作用不同，黄芩为高度敏感，黄连、金银花、蒲公英为中度敏感，马齿苋、地锦草、板蓝根、大青叶、栀子为轻度敏感，车前草为不敏感。同时，不同菌株对同一药物的敏感性并不完全一致，甚至有的偏差较大，如两株菌对蒲公英的抑菌直径相差2 mm。见表1。

表1 不同药材对两株蜂房球菌的敏感性

2.2 不同药材对两株蜂房球菌的MIC

黄芩对两株蜂房球菌的抑菌效果最好，MIC 为15.625 mg/ml，黄连、金银花次之，MIC 为31.25 mg/ml。但不同菌株对少数药物的MIC结果并不一致，如黄连、马齿苋、蒲公英、板蓝根。见表2。

表2 不同药材对两株蜂房球菌的MIC 结果

2.3 不同药材对两株蜂房球菌的MBC

黄芩对两株蜂房球菌的抑菌效果最好，MBC 为31.25 mg/ml，黄连、金银花次之，MBC 为62.5 mg/ml,但不同菌株对少数药物的MBC 结果并不一致，如黄连、马齿苋、蒲公英、板蓝根。见表3。

表3 不同药材对两株蜂房球菌的MBC 结果

3 结论与讨论

近年来，由于抗生素的长期不合理使用，导致形成耐药菌出现和药物残留，引起了人们对生命健康的极大关注[5]。中草药来源丰富，活性成分多，毒副作用小，具有广谱抗菌作用且不易产生耐药性，在替代抗生素使用上具有独特的优势。

试验结果表明，在所选取的10味常用中药材中，有9 味药材对蜜蜂蜂房球菌有一定的抑制作用，抑制作用在一定浓度范围内随着药物浓度的增大而增强，呈线性关系。抑菌圈大小与MIC 值、MBC 值有一定的平行关系，但又不完全相符。同时，不同菌株对同一种药物的活性也存在一定差异，出现这种现象可能是由于试验方法不同或者蜂房球菌难以培养等造成的差异，具体原因有待于进一步研究分析。

虽然具有强抑菌作用的仅有1 味黄芩，另外3味表现出中度敏感，5 味表现出轻度敏感，但通过体外抑菌试验并不能完全证实中度和轻度敏感药材的实际抑菌效果就一定差，因为中药的成分比较复杂，不同提取方式对活性成分的溶出也会有很大影响，以及不同活性成分在体内的作用靶点也不一致。受试验条件限制，本试验未考虑提取方式等带来的影响，将在今后研究中进一步加以解决。