庞月红，王逸盈，孙梦梦，沈晓芳，张 毅

（江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

在过去的20 a中据统计全球转基因作物的播种面积空前增长，到2018年达到1.917亿 公顷，为全球大豆总种植面积的78%，约占全球转基因作物总种植面积的50%[1]。CP4-5-烯醇丙酮酸酯-3-磷酸合酶基因（CP4-5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase gene，CP4-EPSPS）是从土壤农杆菌CP4菌株中克隆的EPSPS基因，是转基因大豆中使用最早、最普遍的抗除草剂性的转基因[2]。转基因大豆的检测主要有两类，一类是基于外源基因表达蛋白的检测，包括分子印迹[3]、酶联免疫[4-5]和试纸条法[6]等。这些基于蛋白质检测的方法耗时，有的需要用检测蛋白的专用仪器。另一类是基于外源基因进行的基因检测[7]。这些基因检测方法包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）结合琼脂糖凝胶电泳[8]、real-time PCR[9-10]、表面等离振子共振[11]等。然而，这些方法仪器昂贵、操作较为复杂。因此，研究操作简单、检测灵敏度高、特异性强的检测转基因大豆分析方法十分有意义。

磁纳米粒子是一种粒径在100 nm左右的超磁性纳米粒子，可以利用其磁性，快速地从复杂体系中分离出目的分子[12]。由于磁纳米粒子可以结合分离生物分子并且具有增强信号的性能，在检测中可被用于结合适配体。特别是近年来，磁纳米粒子在传感器中被广泛应用[13-14]。

激光诱导荧光（laser induced fluorescence，LIF）技术用于测定激光诱导的液体中荧光[15]。由于其检出限范围从nmol/L到pmol/L[16]，且稳定性强，LIF已成为最灵敏的检测方法之一。LIF已经被广泛应用在结合毛细管电泳[17]、高效液相色谱[18]和微流控技术[19]等。此外，LIF检测被用于提高分子灵敏度和选择性[20]。本实验建立一种LIF结合磁分离检测CP4-EPSPS基因的方法。通过制备磁纳米捕获探针，利用DNA碱基配对的特异性和磁纳米粒子的磁分离，通过高灵敏度和准确性的LIF，实现CP4-EPSPS基因的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

转基因大豆干粉 美国分析化学家协会；氨基磁纳米粒子（magnetic nanoparticles， MNPs）（10.0 nm）南京东纳米生物公司；用于配制缓冲液的试剂以及戊二醛国药集团化学试剂有限公司；亲和素、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、核苷酸序列 生工生物工程（上海）股份有限公司。

从转基因大豆中提取用于PCR扩增的DNA样品。使用大豆CP4-EPSPS基因的寡核苷酸引物进行PCR，核苷酸序列见表1。

表1 本方法所用核苷酸序列Table 1 Sequences of oligonucleotides used in this work

1.2 仪器与设备

UV-1100紫外分光光度计 日本日立公司；F-7000荧光分光光度计 日本岛津公司；XW-80A旋涡混合器上海精科实业有限公司；TriSepTM-2000 LIF检测器上海通微有限公司；LSP02-1B注射泵 中国兰格恒流泵有限公司；T100TMPCR仪 美国Bio-Rad公司；Nicolet 10傅里叶变换红外光谱仪 中国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制备捕获探针修饰的MNPs

首先将200.0 µL 4.0 mg/mL的MNPs溶液加入到1.6 mL含25%的戊二醛-磷酸缓冲液（pH 8.0）中，室温下避光混合振荡2 h，磁分离后得到戊二醛修饰的MNPs。然后加入0.5 mg/mL的亲和素，室温下避光混合振荡6 h，冲洗3 次后得到亲和素化的MNPs。将生物素化的捕获探针（cDNA）加入上述溶液，混合振荡孵育30 min，通过生物素-亲和素系统固定在MNPs表面[21]。然后加入1.0 mg/mL的BSA溶液封闭未结合的位点，用磷酸盐缓冲液磁分离清洗后，得到捕获探针修饰的磁纳米粒子（cDNA-MNPs）。

1.3.2 在线检测方法的设计与建立

先向50.0 µL cDNA-MNPs溶液中加入50.0 µL FAM标记的信号探针（sDNA）和50.0 µL一定浓度的CP4-EPSPS目标基因（tDNA），混合液95 ℃加热5 min后，冰浴5 min。然后将所得混合液在室温下孵育30 min形成稳定结构sDNA-tDNA-MNPs，并通过注射泵以一定速度注入毛细管。毛细管下方带有磁场，在磁场和流体动力阻力的作用下，将混合物与毛细管中未结合的杂质分离。通过LIF检测器，不与cDNA-MNPs杂交的FAM探针形成荧光信号平台。当荧光信号降低到零时，即无边界的FAM探针被完全冲洗掉。然后去除磁场，以高流速冲洗毛细管，被磁场富集的FAM-tDNA-MNPs夹心结构快速通过LIF检测器，出现一个荧光信号峰。

1.3.3 样品中CP4-EPSPS基因的检测

首先根据SDS方法从转基因大豆粉中提取DNA样品。将0%、0.5%、1.0%和10.0%的转基因大豆DNA掺入非转基因大豆中，并通过PCR扩增稀释后的DNA，以获得相应的长片段。然后将6 µL的PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖为1%，电压为5 V/cm，电泳时间为40 min。最后，将PCR产物用10.0 mmol/L Tris-HCl稀释，通过在沸水浴中加热5 min而变性，然后在冰浴中冷冻2 min，以获得单链DNA溶液。将这种方法检测CP4-EPSPS的结果与传统PCR方法进行比较。

2 结果与分析

2.1 LIF结合磁分离在线传感检测技术的构建

构建原理如图1所示，首先通过戊二醛反应使氨基MNPs表面结合上亲和素，亲和素化的MNPs与生物素化的捕获探针进一步混合反应，并用BSA溶液封闭未结合的位点[22]，得到捕获探针修饰的MNPs（cDNAMNPs）。随后，将得到的cDNA-MNPs溶液与信号探针和CP4-EPSPS基因溶液混合后注入毛细管，在磁场的作用下分离杂质。当荧光信号归零时再撤去磁场，通过LIF检测器得到荧光信号峰，峰面积可用于CP4-EPSPS基因的检测和定量。

图1 LIF结合磁分离的在线传感原理图Fig. 1 Schematic diagram of LIF combined with magnetic separation on-line sensing detection

2.2 MNPs修饰过程的表征

为验证cDNA是否成功地修饰到MNPs上，对每个修饰过程表征。如图2A所示，戊二醛在233 nm波长处有较强的特征吸收峰，在280 nm波长处有较弱的特征吸收峰。MNPs本身没有特征吸收峰，而与MNPs反应后的戊二醛在233 nm波长处的紫外吸收峰值有所下降，280 nm波长处的紫外吸收峰值有红移，表明戊二醛与MNPs发生席夫碱反应，从而使MNPs活化。如图2B所示，亲和素在285 nm波长处有很强的紫外吸收峰。与MNPs反应后，上清液中的亲和素在285 nm波长处的紫外吸收峰值明显下降，说明亲和素已经成功地共价结合到MNPs的表面。如图2C所示，MNPs在586 cm-1和1 073 cm-1处均有吸收峰，586 cm-1处为Fe—O键的振动峰，1 073 cm-1为Si—O键的伸缩振动峰。而经亲和素修饰后除了MNPs的特征峰外，在1 642 cm-1及1 576 cm-1处出现新的仲酰胺特征峰，对应为C＝O键的伸缩振动峰。在2 928 cm-1处为—CH2的C—H键伸缩振动峰，3 400 cm-1处为N—H键的伸缩振动峰，与—OH伸缩振动峰发生重合，且在这两处的峰均变宽变强，表明亲和素已经成功地修饰到MNPs上。cDNA是一端修饰有生物素的捕获基因，在260 nm波长处有紫外吸收峰，根据反应前后原体系中的cDNA含量可以判断cDNA是否连接到亲和素化的MNPs上。如图2D所示，cDNA结合亲和素化的MNPs后在260 nm波长处的吸收峰有明显的下降，表明已将cDNA成功装配到亲和素化的MNPs表面上，形成了cDNA-MNPs。

图2 MNPs修饰过程表征Fig. 2 Characterization of MNPs modification

2.3 检测方法可行性分析

制备好的cDNA-MNPs、FAM荧光标记的信号探针和CP4-EPSPS基因室温孵育30 min。将混合液以一定的速度泵入毛细管中以冲洗杂质，并记录色谱图。如图3A所示，对照组的荧光信号图谱，当注入混合液时出现荧光信号平台，继续冲洗除去未结合的FAM探针，荧光信号降为0。撤掉毛细管下方的磁场，使用较大的流速推动混合物通过LIF检测器，此时无荧光信号，表明没有夹心结构即没有检测到CP4-EPSPS基因。如图3B所示，当冲洗掉未结合的FAM探针并且荧光信号消失时，相对荧光单元（relative fluorescence unit，RFU）也具有一个平台。除去磁场后，通过LIF检测器有荧光信号峰出现，表示有CP4-EPSPS基因存在，通过计算荧光峰的面积可以得出CP4-EPSPS基因的浓度。整个过程共用时3 min，表明该方法可以快速且有效地检测CP4-EPSPS基因。

图3 CP4-EPSPS基因荧光信号图谱Fig. 3 Fluorescence signal spectra of the CP4-EPSPS gene

2.4 实验条件的优化

MNPs质量浓度对最终FAM-tDNA-MNPs结构的荧光强度有影响，为实现准确分析，研究MNPs质量浓度对实验结果的影响。如图4A所示，MNPs质量浓度从0.1 mg/mL增加到0.3 mg/mL，荧光峰面积也随之增加，在0.4 mg/mL时达到最大值，之后随着质量浓度的增加荧光峰面积下降。

通过基因探针cDNA与MNPs特异性结合，从而实现信号的检测，因此基因探针cDNA浓度直接影响实验的结果。如图4B所示，与MNPs偶联后，使用cDNA从样品中捕获CP4-EPSPS基因。增加MNPs上的cDNA负载可以增加与CP4-EPSPS基因结合的cDNA的亲和力和数量，从而提高捕获效率。荧光峰面积随着cDNA浓度的增加而增加，在100 nmol/L时达到最高，浓度再增加，荧光峰面积降低。

图4 实验条件的优化Fig. 4 Optimization of experimental conditions

本实验用BSA作为封闭剂[22]，减少荧光素与MNPs的接触，并且起到了分散MNPs的作用，有助于改善灵敏度和可重复性。如图4C所示，随着BSA质量浓度的增加，荧光峰面积增加，并在1.0 mg/mL达到最高。BSA过剩会影响DNA杂交实验，因此在1.0 mg/mL之后随着质量浓度的增高，荧光峰面积下降。综上所述，选择1.0 mg/mL BSA作为最佳质量浓度。

2.5 LIF结合磁分离在线检测

在信号探针和cDNA-MNPs存在的情况下，通过杂交反应实现CP4-EPSPS基因的检测。根据优化条件，LIF用于检测一系列不同浓度的CP4-EPSPS。如图5A所示，荧光图谱中荧光峰信号随着CP4-EPSPS基因浓度的增加而增强。如图5B所示，建立了荧光峰面积与CP4-EPSPS基因浓度之间的线性关系，线性方程为y=31.31lgx+69.52，R2=0.993，线性范围为1.0×10-11～2.0×10-7mol/L，检出限为4.0×10-12mol/L（RSN=3）。与文献[23-29]相比（表2），本方法由于无需扩增且磁性纳米粒子具有分离和富集的双重功能，因此，具有较宽的线性范围和较低的检出限。

图5 不同浓度CP4-EPSPS基因的荧光检测Fig. 5 Fluorescence detection of CP4-EPSPS gene at different concentrations

表2 不同传感器对转基因片段检测效果比较Table 2 Figures of merit of several different biosensors for detection of transgenic fragments

2.6 方法特异性的检测结果

为了检验本方法的特异性，以空白试剂、CP4-EPSPS基因、2 个碱基错配的基因序列、5 个碱基错配的基因序列及随机序列作为研究对象，浓度均为100 nmol/L。如图6所示，由于错配的基因无法有效地与探针杂交形成稳定的双链体复合物，本方法具有较高的特异性。

图6 不同基因的荧光信号Fig. 6 Comparison of fluorescence peak areas for different genes

2.7 实际大豆样品的检测

研究表明，生物传感器能进一步测定PCR扩增的转基因大豆实际样品[30]。运用本方法检测转基因大豆样品，并与传统的生物技术检测方法PCR进行比较。首先，通过PCR，对转基因大豆的DNA序列进行扩增，对扩增样品进行编号。如图7A所示，随着转基因大豆含量的增加，荧光峰面积明显增加，且可以成功地将其与非转基因大豆和空白进行区分。如图7B所示，1、2、3号的扩增样品在207 bp处有明显的条带，表明含有CP4-EPSPS基因，而在非转基因大豆和空白对照组中没有发现任何条带。通过与传统PCR方法比较，两种方法检测到的结果一致，且检测在3 min内即可完成，表明了LIF在线检测方法实际可行。

图7 转基因大豆扩增产物检测Fig. 7 Detection of genetically modified soybean amplification products

3 结 论

本实验成功地建立了一种LIF结合磁分离技术用于在线检测转基因大豆中的CP4-EPSPS基因的方法。该方法具有高特异性、低检出限和短检测时间，并用于检测转基因大豆样品的PCR扩增产物，表明该方法可用于检测转基因大豆中的CP4-EPSPS基因。同时，与传统PCR相比，具有更低的仪器成本，更加便捷化的前景，同时材料的批量生产也更符合工业化和快检技术的要求。