闫 涵，范文来，徐 岩

（教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）

酿酒原料是决定白酒产量和质量的物质基础，不同品种的原料赋予酒体不同的风格[1]。在微生物的作用下，原料中的基质组分经过发酵会产生多种风味物质。此外，原料本身具有的微量成分也会对酒体风味产生重要影响[2-3]。通常情况下，使用单一原料酿酒（单粮型白酒）时，原料多采用高粱或大米（米香型等）；使用多种粮食酿酒（多粮型白酒）时，大部分以高粱为主，并辅以大米、小麦、糯米、玉米等原料[4]。由于原料品种及配比的差异，单、多粮型白酒具有不同的风味特征[5]。

目前，关于不同原料酿造白酒的差异性研究多集中于微生物代谢[6-7]、生产工艺[8]和原酒风味成分[9-11]等方面，而针对白酒在发酵过程中挥发性成分的研究较少。鉴于此，本研究通过跟踪单粮和多粮酿造的馥合香型白酒（兼具浓香、酱香和芝麻香）在发酵过程中酒醅的挥发性成分变化，比较不同原料酿造的白酒酒醅在发酵过程中挥发性成分生成量的差异，采用化学计量学方法，找出关键差异化合物，确定不同原料对白酒发酵过程的影响，为白酒生产过程的品质调控提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以单粮或多粮为原料生产的馥合香型酒醅由安徽金种子酒业股份有限公司提供。馥合香型酒醅堆积发酵期3 d，入池发酵期60 d，分别取堆积发酵第0、1、2、3天和入池发酵第1、5、10、15、20、30、40、50、60天的样品。酒醅取样时，选取4 个实验窖池，同一发酵车间正常发酵的4 个窖池作为平行对照。分别取窖池上、中、下层中心处的酒醅，等量混合均匀，封口袋密封保存后于-20 ℃冷冻保藏。

氢氧化钠、无水葡萄糖、浓盐酸、五水硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、无水乙醚、无水氯化钙、氯化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、内标丙酸辛酯、叔戊酸和86 种化合物标准品（均为色谱纯） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

GC 6890N-MSD 5975气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪、DB-FFAP柱（60 m×0.25 mm，0.25 µm） 美国Agilent公司；自动进样器（MPS2） 德国Gerstel公司；50/30 µm DVB/CAR/PDMS顶空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）萃取头美国Supelco公司；Organomation N-EVAP氮吹仪美国Organomation公司；5810R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Milli-Q超纯水系统 德国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅中淀粉和还原糖的测定

参考T/CBJ 004—2018《固态发酵酒醅通用分析方法》[12]，对酒醅中淀粉和还原糖进行检测。

1.3.2 HS-SPME结合GC-MS测定挥发性化合物

参考高文俊[13]的方法，称取10 g酒醅样品，加入1%无水CaCl2和20 mL煮沸过的超纯水混匀，于4 ℃冰箱内浸泡过夜。冰水浴超声30 min，在4 ℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液。

吸取8 mL上清液置于20 mL顶空瓶中，加3 g NaCl和内标丙酸辛酯（终质量浓度86.68 µg/L），密封后进行HS-SPME-GC-MS分析[13]。

标准曲线：配制不同质量浓度梯度各化合物的标准液，取每个梯度标准液8 mL进行HS-SPME-GC-MS分析。采用选择离子法，以待测物与内标峰面积之比为横坐标，质量浓度之比为纵坐标分别绘制标准曲线。

1.3.3 液液微萃取（liquid-liquid microextraction，LLME）结合GC-MS定量挥发性酸类化合物

由于HS-SPME方法中使用的三相萃取头对强极性挥发性脂肪酸类化合物的萃取效果不佳，所以采用LLMEGC-MS测定挥发性酸类化合物[14]。酒醅的预处理方法与1.3.2节相同。

吸取18 mL上清液，加入6 g NaCl、内标叔戊酸（终质量浓度3 406 µg/L）和1.5 mL重蒸乙醚，振荡萃取3 min，静置分层后吸取上层有机相于2 mL离心管中，于4 ℃、12 000 r/min离心3 min去乳化。吸取1 mL有机相于2 mL气相小瓶中，氮吹浓缩至250 μL。取1 μL进行GC-MS分析。GC-MS分析条件与1.3.2节相同。

标准曲线：配制不同质量浓度梯度酸类化合物标准液，取每个梯度标准液18 mL进行LLME-GC-MS分析。标准曲线绘制方法与1.3.2节相同。

1.4 数据分析

利用SPSS 23.0对定量数据进行方差分析（analysis of variance，ANOVA），采用SIMCA-P+（v13.0）进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squaresdiscrimination analysis，OPLS-DA）。

2 结果与分析

2.1 单粮和多粮型白酒在发酵过程中挥发性化合物含量差异分析

采用LLME-GC-MS和HS-SPME-GC-MS方法在单粮和多粮酿造的馥合香型白酒酒醅中共鉴定出86 种挥发性化合物，其中酯类34 种，酸类9 种，醇类8 种，醛酮类4 种，呋喃类4 种，内酯类2 种，芳香族12 种，酚类7 种，含氮化合物4 种，以及含硫化合物2 种。

不同原料酿造的酒醅在发酵过程中挥发性化合物的生成量相差不大。与发酵前酒醅中含有的挥发性化合物总量相比，单粮酒醅中挥发性化合物总量增加3.09 g/kg，多粮酒醅中挥发性化合物总量增加3.03 g/kg，单粮酒醅中的挥发性化合物总生成量比多粮酒醅高1.94%（表1）。

表1 不同原料酿造白酒发酵过程中挥发性化合物增量的比较Table 1 Comparison of volatile compounds increments during liquor fermentation from single and multiple grains

相比多粮酒醅，单粮酒醅在发酵过程中产生了更多的酚类和酸类化合物。酚类化合物具有一定的抗菌和抗氧化活性[15]，但多是白酒中的异嗅物质[16]，主要来源于原料中木质素的降解[17]。酚类化合物在单粮和多粮酒醅发酵过程中含量分别增加3.71 mg/kg和2.4 mg/kg，单粮酒醅中酚类化合物含量比多粮酒醅多产生了35.31%。通常，单一高粱原料中酚类化合物的含量显著高于其他酿酒原料，且在发酵和蒸馏过程中，微生物可以将原料中的谷物酚类物质分解成挥发性的酚类物质，部分谷物酚类物质也会残留在酒醅当中[18]，进一步解释了单粮酒醅在发酵过程中会产生更多酚类物质的原因。酸类化合物不仅是白酒中重要的呈香、呈味物质，同时也影响着微生物的生长代谢[19-21]。原料和酒曲中糖在微生物的作用下分解产生大量有机酸类物质[19]。酸类在单粮和多粮酒醅发酵过程中含量分别增加了1.39 g/kg和1.0 g/kg，单粮酒醅比多粮酒醅多产生了28.06%酸，与文献报道的结果类似[22]。

多粮酒醅在发酵过程中较单粮酒醅产生更多的醇类和含氮化合物。醇类化合物主要来源于糖和氨基酸的降解[23]，是两种酒醅在发酵过程中生成量差异最大的一类化合物。在发酵过程中，单粮和多粮酒醅中醇类化合物含量分别增加2.89 mg/kg和12.83 mg/kg，多粮酒醅中醇类含量比单粮酒醅多产生了3.44 倍。其中含量差异较大的化合物为2-甲基丙醇和3-甲基丁醇，均在多粮酒醅发酵过程中生成量较高。含氮化合物也是两种酒醅发酵过程中生成量差异较大的一类化合物，本研究共检测到4 种含氮化合物，包括3 种吡嗪类物质和2-乙酰基吡咯，均在多粮酒醅中含量较高。含氮化合物在单粮酒醅中含量增加0.35 mg/kg，在多粮酒醅中含量增加0.96 mg/kg，多粮酒醅中含氮化合物的含量比单粮酒醅多产生了174%；研究发现多粮酒醅中杂环化合物的种类和含量较高，与本实验的研究结果类似[6,17]。

虽然单粮和多粮酿造的白酒酒醅中检测到化合物种类基本相同，产生的化合物总量相差不大，但是各类化合物在发酵过程中的生成量存在一定差异。这可能是由于不同的原料品种具有不同的化学成分组成以及有差异的微生物群落结构[6-7]，导致发酵过程中微生物代谢生长环境存在一定的差别，进而影响到酒醅中挥发性成分的生成。

2.2 单粮和多粮型白酒在发酵过程中的关键差异化合物

为了找出单粮和多粮酿造的白酒在发酵过程中可能存在的关键差异化合物，应用OPLS-DA模型分别对两种酒醅中检测到的86 种挥发性化合物在发酵过程中的增量进行分析（图1）。该模型能将两种酒醅明显区分开，模型解释率和模型预测能力Q2分别为0.508、0.973、0.505，其中接近于1且Q2＞0.5，说明模型质量较好。根据OPLS-DA模型中的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值（VIP＞1.0）筛选出潜在的差异化合物，然后对其进行ANOVA，将其中具有显著性差异的化合物（P＜0.05）认为是单粮和多粮酿造白酒酒醅中的关键差异化合物。

图1 不同原料酿造白酒发酵过程中挥发性化合物增量的OPLS-DA得分图Fig. 1 OPLS-DA score plot for volatile compound increments during liquor fermentation from single and multiple grains

通过OPLS-DA发现，单粮和多粮酿造白酒酒醅在发酵过程中的关键差异化合物有6 种，其中包括两种酯类物质，分别为乙酸己酯和肉豆蔻酸乙酯；两种芳香族类物质，分别为苯乙醛和苯甲醇；以及两种含氮化合物，分别为6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪。各化合物在单粮和多粮酒醅发酵过程中的增量变化如表2所示，除苯乙醛以外，其他的关键差异化合物均在多粮酒醅发酵过程中的生成量较高。

表2 发酵过程中关键差异化合物增量的比较Table 2 Comparison of the contents of key differential compounds during the fermentation process

研究发现，单粮酿造有利于酒醅中苯乙醛含量的累积。苯乙醛是白酒中重要的香气化合物，具有玫瑰花香，主要由原料中的苯丙氨酸脱氨基和羰基产生，可在还原酶作用下被还原为苯乙醇[23]。单粮和多粮酒醅中苯乙醛含量分别增加183.09 μg/kg和54.04 μg/kg。单粮酒醅中苯乙醛含量比多粮酒醅多产生了70.48%。这主要是由于高粱中所含的蛋白质含量高于多种粮食混合的蛋白质含量[24]，且高粱具有较高含量的苯丙氨酸，苯丙氨酸可以在氨基酸转氨酶作用下生成更多的苯乙醛等物质[25]，使得单粮酒醅中苯乙醛生成量更高。该研究结果与前期关于浓香型白酒酿造体系中苯乙醛含量差异研究结论具有一致性[26]。

多粮酿造有利于酒醅中乙酸己酯、肉豆蔻酸乙酯、苯甲醇、6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的生成。其中，6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪均属于吡嗪类物质，在多粮酒醅中的生成量分别比单粮酒醅高164%和539%。本研究还检测到了2,3,5,6-四甲基吡嗪，其在单粮和多粮酒醅发酵过程中含量分别增加11.75 μg/kg和16.05 μg/kg，多粮酒醅比单粮酒醅多产生了36.58%。多粮酒醅在发酵过程中吡嗪类物质总含量增加了591.9 μg/kg，显著高于单粮酒醅（P＜0.05）。吡嗪类物质是白酒中特有的风味成分，具有烘烤和坚果香气[21,23]。Fan Wenlai等[17,27]对洋河大曲、五粮液、剑南春等浓香型白酒中的香气成分进行分析，发现相比于洋河大曲（单粮型白酒），五粮液和剑南春等多粮型白酒中可能含有更多的吡嗪；Tan等[6]研究发现单粮酒醅中吡嗪类化合物的种类和含量均低于多粮混合酒醅，这与本实验的结果类似。这些结果表明，多粮酒醅在发酵过程中生成更高含量的吡嗪类化合物，这可能是多粮酒醅不同于单粮酒醅的典型特征。

白酒中的吡嗪类化合物主要来源于微生物的代谢反应，通常产生于堆积发酵、入池发酵和蒸馏过程[28]。其生物合成途径可分为2 个阶段：第1阶段是通过枯草芽孢杆菌糖代谢和氨基酸转化过程积累代谢产物乙偶姻和氨，第2阶段是代谢产物乙偶姻与发酵环境中的氨发生非酶促反应生成吡嗪类化合物[28-29]。相比于单一高粱发酵，多种粮食的混合提高了白酒酒醅发酵过程中淀粉和还原糖的含量（图2），使酒醅中葡萄糖含量增加，可能促进了吡嗪类物质的前体乙偶姻的生成从而提高了吡嗪类物质的含量[30]，因此在酿造过程中使用多粮为原料更有利于酒醅中吡嗪类化合物的生成。另外，吡嗪类物质是酱香型和芝麻香型白酒的重要香气成分[31]，对于兼具浓香-酱香-芝麻香的馥合香型等香型白酒而言，酒醅中吡嗪类物质含量较高可能对白酒整体风味具有一定的贡献。

图2 不同原料品种酒醅中淀粉（a）和还原糖（b）含量变化Fig. 2 Changes in starch (a) and reducing sugar (b) contents of two fermented grains during fermentation

3 结 论

本实验采用HS-SPME-GC-MS和LLME-GC-MS的方法，在单粮和多粮馥合香型白酒发酵过程中的酒醅中共检测到86 种化合物。虽然单粮和多粮酿造的白酒酒醅中检测到化合物种类相同，产生的化合物总量相差不大，但是各类化合物在发酵过程中的生成量存在一定差异。单粮发酵有利于酚类和酸类化合物生成，而多粮发酵有利于醇类和含氮化合物的生成。采用OPLS-DA筛选出单粮和多粮酿造白酒酒醅中的关键差异化合物，发现单粮有利于苯乙醛的生成；而多粮有利于乙酸己酯、肉豆蔻酸乙酯、苯甲醇、6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的生成。综合分析发现，多粮酒醅在发酵过程中生成更高含量的吡嗪类化合物，这可能是多粮酒醅不同于单粮酒醅的典型特征。本研究分析了单粮和多粮型白酒在发酵过程中挥发性组分形成的差异，确定不同原料对白酒发酵过程的影响，对进一步优化白酒发酵生产工艺、揭示白酒发酵机理具有一定指导意义。