靳天慧，陈 亮,2，刘叶红，盛 瑛,2，宗刚军,2

血管钙化在动脉粥样硬化性心脑血管疾病以及肾功能衰竭的患者中非常普遍。内皮细胞和血管平滑肌细胞的衰老，细胞外基质沉积以及血管周围脂肪组织的炎症反应等机制都参与了血管钙化的发生和发展。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexin type 9，PCSK9)由参与动脉粥样硬化的多种细胞(如内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞)表达，并在人的动脉粥样硬化斑块内被检测到。PCSK9通过激活巨噬细胞，释放促炎细胞因子，来调节炎症，这是钙化的关键因素。单次注射获得功能突变的PCSK9腺相关病毒载体，可在没有基因修饰的小鼠中诱发心血管钙化。因此，PCSK9有可能成为新的预防和治疗血管钙化性疾病方法的潜在分子靶点。该研究旨在探讨抑制PCSK9对人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells，HAEC)钙化的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

HAEC购于美国ATCC细胞库。DMEM高糖培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司；胰酶细胞消化液、Western及IP细胞裂解液购于上海碧云天生物技术有限公司；RNA快速提取试剂盒购于上海奕彬生物科技有限公司。一抗骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2、BMP4购于美国Abcam公司；一抗PCSK9购于美国Abways公司；LipofectamineTM 3000 购于美国ThermoFisher公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；小干扰RNA si-PCSK9购于北京擎科生物科技有限公司；HiScript Reverse Transcriptase、ChamQ SYBR qPCR Master Mix购于南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 方法

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细胞培养与分组 HAEC在含有10%胎牛血清+1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM高糖培养基中培养，置于5% CO、37 ℃培养箱中。① 磷酸盐在血管钙化中起着核心作用，分别使用(0、10、30、50 mmol/L)β甘油磷酸+50 μg/ml L-抗坏血酸+100 nmol/L 地塞米松刺激HAEC 10 d，筛选出诱导细胞钙化的最佳浓度并检测PCSK9的表达。……