周 琳，蔡文静，杨 慧，吴梦楠，郑营雪

自然界多数细菌以生物膜的形成存在，该存在形式对宿主的致病性明显高于单种细菌。因为细菌生物膜能够降低宿主免疫系统的敏感性，增强细胞毒力和对抗生素的耐受性。该研究中的Nisin是由乳酸链球菌产生的具有34个氨基酸的小分子抗菌肽，有抗菌性、低毒、生物相容性，难以使细菌产生耐药性等多种优异性能。并且，Nisin易被分解成氨基酸，不会污染环境。因此，被广泛用于食品抗菌防腐保鲜领域。MTAD(多西霉素、柠檬酸、吐温-80混合物)中多西环素使细菌产生耐药性以及生物安全性不高的特点使其抗菌性受到影响，通过将MTAD中的多西环素换成Nisin，形成新的混合物MTAN，提高抗菌性以及生物安全性。Nisin的诸多优点，使MTAN成为一个很有前途的抗菌新药。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牙龈卟啉单胞菌(BNCC337441)、具核梭杆菌(BNCC337608)、血链球菌(BNCC134927)均来自北京北纳创联生物技术研究院；Nisin(北京索莱宝科技有限公司)，柠檬酸(天津市瑞金特化学品有限公司)，乙二胺四乙酸(EDTA，北京索莱宝科技有限公司)。Lambda35分光光度计(美国珀金埃尔默有限公司)，Blue pard 37 ℃恒温箱(上海一恒科学仪器有限公司)，2.5 L厌氧产气袋(日本三菱瓦斯化学株式会社)。

1.2 方法

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MTAN溶液的配制 每10 ml MTAN标准液由0.3 g Nisin粉、0.425 g柠檬酸粉、0.05 ml吐温-80和9.95 ml无菌水(由三蒸水在121℃，20 min高温高压蒸汽灭菌而得)配制而成。

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混合菌液的制备 血链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌分别复苏活化增菌计数稀释。将3种菌悬液各取150 μl×2两菌种混匀，再各取100 μl×1三菌种混匀，制成混合菌悬液4种。

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实验步骤 分组如表1。测量各组初始吸光度(optical density, OD)值，37 ℃厌氧培养24 h。从阴性对照组(分组1和分组2中)混合溶液各取100 μl进行稀释、涂板，相同条件培养96 h后计数，3次取均值，计算血链球菌+具核梭杆菌初始活菌数。余组测量OD，将培养前后OD值改变在0.05以下的药物浓度记为最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)，计算MIC的抑制率。

从高于MIC的菌液中取100 μl，操作同阴性对照组，计血链球菌+具核梭杆菌活菌数，其中降低99.9%最小抗菌浓度为最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)。当阴性对照组混合液明显浑浊，空白对照组液体清亮，实验才有效。排除药物对OD影响，使用较正后OD。

表1 MTAN,MTAN+EDTA作用于血链球菌+具核梭杆菌的实验分组(n=3)

200μl 血链球菌+具核梭杆菌离心，弃上清液，PBS轻吹，分组a(200 μl MTAN标准液)、b(200 μlMTAN标准液+ 20 mmol/L EDTA)、c(200 μl无菌水)，均处理1、5、10 min，离心，弃上清液后PBS轻吹，溶解、稀释、涂板、培养、计数，计算生存率。若c组细菌平板细菌正常生长且平行组细菌生存数基本一致，实验才有效。同样步骤计算MTAN、MTAN+EDTA(20 mmol/L)处理血链球菌+牙龈卟啉单胞菌、牙龈卟啉单胞菌+具核梭杆菌、三菌种混合菌液的MIC、MBC，检测3种混合菌液经处理后的生存率。

1.3 统计学处理

使用SPSS21.0统计软件对MTAN处理后的血链球菌+具核梭杆菌、血链球菌+牙龈卟啉单胞菌、牙龈卟啉单胞菌+具核梭杆菌、三菌种混合菌液组和阴性对照组数据进行配对

t

检验，MTAN+EDTA组同样，对用MTAN以及MTAN+EDTA作用后的四种混合菌悬液组分别进行配对

t

检验。以

P

<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTAN和MTAN+EDTA处理不同混合菌液的MIC和MBC

MTAN和MTAN+EDTA对血链球菌+具核梭杆菌、血链球菌+牙龈卟啉单胞菌、牙龈卟啉单胞菌+具核梭杆菌、三菌种混合菌液均有抑制作用，其MIC、MBC见表2、3。MTAN及MTAN+EDTA作用各个混合菌液各时间后活菌率，具体结果见表4。

2.2 统计学分析

当Nisin浓度≥1 μg/ml，4种混合菌液组和阴性对照组之间差异均有统计学意义(

P

<0.05)。MTAN+EDTA各组和MTAN组之间差异均有统计学意义(

P

<0.05)。见表5、6。

表2 MTAN处理不同混合菌液的MIC及MBC

表3 MTAN+EDTA处理不同混合菌液的MIC及MBC

表4 MTAN及MTAN+EDTA作用各个混合菌液各时间后活菌率(n=3)

表5 配对样本t检验(n=3)

表6 MTAN组和阴性对照组比较的具体统计学结果

3 讨论

口腔细菌从浮游状态生长到成熟状态的生物膜，对抗菌剂的敏感性降低，耐酸和抗饥饿能力增强，致病作用也更强和复杂。本实验中MTAN 发挥抑菌效果的主要成分是Nisin。Nisin对革兰阳性菌(G)有抑杀作用，G细胞壁结构简单，Nisin和细胞膜脂质体Ⅱ分子结合，形成孔隙，发挥抗菌作用。革兰阴性菌(G)细胞壁结构复杂，只允许分子量在600 Da以下分子通过，阻碍了Nisin(3 500 Da)的直接作用，但柠檬酸可破坏细胞壁，提高Nisin抑杀G的作用。初期实验发现，MTAN以及MTAN+EDTA对种植体周围炎致病菌都存在抑杀作用。本实验基于上述基础，研究MTAN对≥2种细菌共同培养的抑杀作用，对将来抑杀更加复杂的生物膜研究起到重要指导作用。

口腔浮游菌在牙齿表面进行早期定植的主要细菌是链球菌属，牙龈卟啉单胞菌是晚期定植细菌，具核梭杆菌能连接二者，形成一个微型种植体周围炎微生物结构。本实验选取这3种细菌进行混合培养，获得比较接近种植体周围炎的微生物生态系统，研究MTAN对种植体周围炎致病混合菌的作用。

本实验中将阴性对照组等量3种细菌悬液和双菌种菌悬液相比，发现三菌种的OD值明显更高，说明三菌种的细菌数更多。本实验中，分组1中的阳性对照组对双菌种混合液的抑制率都在71.0%以上，但对三菌种混合液的抑制率是70.75%，且都未完全杀死混合菌。由此得出，混合微生物对药物的耐受能力更高。和前期研究结果对比，本次实验中，MTAN作用于混合菌液的MIC和MBC相较作用于单菌种菌液都提高了数倍，可能是混合细菌存在复杂的结构和性质降低了细菌对MTAN的反应。再次说明和单一细菌相比，混合菌的抵抗能力更强。本实验中的三菌种混合菌液的MIC和MBC是双菌种的2～4倍。这进一步说明多种细菌共同产生作用，增加了抵抗抗菌剂的能力。

氯己定漱口液的口腔推荐用量为：20 mg及18 mg，而本实验中MTAN的MBC分别是250、500 μg/ml。所以和氯己定相比，MTAN有诸多优点：MTAN中的Nisin不着色，无异味，生物活性稳定，抗菌作用强，范围广，生物安全性高。同时，Nisin的生产技术在不断更新，发酵泡沫分离耦合工艺，乳链球菌亚群共培养，益生菌刺激等都能增加Nisin的产量，降低Nisin的生产费用，使得MTAN拥有更大的使用前途。

EDTA作为螯合剂，能够与Mg、Ca、Fe等二价金属阳离子结合，破坏细菌生物膜的稳定性，增加细胞对Nisin的敏感性和渗透性，所以EDTA能够辅助增强抗菌剂抗菌。本实验中MTAN+EDTA(20 mmol/L)对混合菌均有抑制作用，且效果比MTAN作用于单菌种甚至混合菌更强。MTAN+EDTA(20 mmol/L)作用下，各组的MBC都存在降低情况。但是单独的EDTA抑菌率达到54.6%，却没有杀灭细菌，这说明EDTA只有抗菌而没有杀菌作用。

本实验中，标准液MTAN作用于各组混合菌1 、5 min后仍有细菌存活，作用10 min后混合菌都死亡。但标准液MTAN+EDTA(20 mmol/L)作用不同时间后，细菌均死亡。因此，EDTA能够且短时间内增强MTAN的抗菌能力。

综上所述，MTAN、MTAN+EDTA对混合细菌均有抗菌作用，其MIC和MBC明显高于单菌种，且EDTA能够增加MTAN的抗菌效果。氯己定和MTAN的比较，MTAN具有很多的优越性，对将来新药的研究提供了指导作用。本研究中，MTAN以及MTAN+EDTA作用于小型种植体周围炎微生物系统，均产生了有效的抑菌作用，对口腔患者种植体周围炎细菌生态系统的新药研究有重要意义。但本实验未涉及生物膜的研究，后续实验正在进行。