刘晓萌，李小燕，张 斌，张 磊，孙平平，李正男

（1 内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，呼和浩特010018）（2 内蒙古师范大学生命科学与技术学院）

葡萄（Vitis viniferaL.）是世界上最古老的果树树种之一，目前，葡萄在世界范围内广泛分布。除鲜食外，葡萄还可用来酿酒和加工成葡萄干。近年来，由葡萄病毒属病毒引起的树体生长衰退、果实品质下降等问题在葡萄产区普遍发生，其中发展最普遍、危害最严重的就是葡萄皱木复合症[1]。对这类病毒的防治已成为葡萄生产上急需解决的问题。

葡萄病毒属属于芜菁黄花叶病毒目乙型线形病毒科。截至目前，侵染葡萄的葡萄病毒属病毒共发现12种，分别是葡萄病毒A（GVA）、葡萄病毒B（GVB）、葡萄病毒D（GVD）、葡萄病毒E（GVE）、葡萄病毒F（GVF）、葡萄病毒G（GVG）、葡萄病毒H（GVH）、葡萄病毒I（GVI）、葡萄病毒J（GVJ）、葡萄病毒K（GVK）、葡萄病毒L（GVL）和葡萄病毒M（GVM）。之前暂定为葡萄病毒属的葡萄病毒C 现被发现不属于葡萄病毒属[2]。

葡萄病毒属病毒粒子为弯曲的杆状或线条状，长约800 nm，直径12 nm，螺旋对称结构。基因组为单分体，线形正义单链RNA 分子，长7.4～7.6 kb，5′端为帽子结构，3′端有poly（A）尾巴。基因组编码5个开放阅读框（ORF）。葡萄病毒属病毒可通过机械接种传播，其中嫁接和繁殖材料是病毒传播最普遍的途径，个别葡萄病毒属病毒也可由粉蚧传播，详见表1。综述了近20 年来侵染葡萄的葡萄病毒属病毒的生物学特性、分子进化现状、致病机制等研究进展情况，并且从NCBI 的GenBank 数据库下载了12种葡萄病毒的基因组序列，共53 条（表1），使用MEGA 6.0 软件，采用NJ 法，自展值设置为1 000，构建了系统发育进化树，基于全长基因组序列对12种葡萄病毒属病毒进行了系统进化分析，加深了对葡萄病毒属病毒种群结构与进化策略的理解，以期为设计合理的葡萄病毒病害防治策略提供依据[3]。

表1 侵染葡萄的葡萄病毒属病毒详细信息

1 侵染葡萄的葡萄病毒属病毒

1.1 葡萄病毒A（GVA）

GVA 最初于1980 年在意大利被发现[4-5]，目前该病毒在世界各地葡萄种植区均有发生，是最为常见的葡萄病毒之一，已在中国、意大利、南非、约旦、捷克共和国等多个国家和地区发生危害，但不同地理区域的发病率差异很大。Boscia 等[6]研究表明，阿尔巴尼亚和马耳他的GVA 感染率最高，而马格里布最低，意大利葡萄品种平均侵染率约为30%。葡萄皱木复合症是在葡萄上严重发生的一类病害，主要引起茎沟、茎痘以及砧木或幼芽木质部扭曲，严重的造成藤早期死亡。根据嫁接到指示植物上的症状，可以将葡萄皱木复合症分为4 类，分别是LN33 茎沟病（LNSG）、沙地葡萄茎痘病（RSP）、克勃茎沟病（KSG）及栓皮病（CB），研究证明，GVA 是克勃茎沟病病原[2,7]。

GVA 自然寄主范围狭窄，木本寄主目前只有葡萄，草本寄主主要是一些烟草，如本氏烟、克利夫兰烟、西方烟、麦格隆熄丰烟及凯维科拉烟。GVA可以通过几种粉蚧传播，可以传播GVA 的粉蚧主要有拟长尾粉蚧（Pseudococcus longispinus）、拟葡萄粉蚧（Pseudococcus affinis）、橘臀纹粉蚧（Planococcus citri）、榕臀纹粉蚧（planococcus ficus）和旧北星粉蚧（Heliococcus bohemicus），还有新棉蚧（Neopulvinaria innumertabitis）及水木坚蚧（Parthenolecanium corni）的幼虫[2]。同时GVA 是传播葡萄卷叶相关病毒1（GLRaV-1）和葡萄卷叶相关病毒3（GLRaV-3）的辅助因子。GVA 基因组正义单链RNA 分子全基因组序列长度为7 349 nt[8-10]，编码5个ORF，其中ORF1 编码RNA 聚合酶（RdRp），ORF2 编码1个19 kDa 但功能未知的蛋白产物，ORF3 编码的是运动蛋白（MP），ORF4编码了外壳蛋白（CP），ORF5 编码1个10 kDa 核酸结合蛋白（NABP）[11-12]。NCBI 的GenBank 数据库可以检索到15 条GVA 的全长基因组序列，通过构建系统发育进化树可以将15个分离物分为2 大组。第1 组包括13 条，分别来自南非、意大利、以色列、法国和克罗地亚，另外1 组包括2 条，分别来自南非和加拿大（图1）。

图1 12种侵染葡萄的葡萄病毒属病毒全长基因组序列系统发育树

GVA 具有基因组的不稳定性，导致了更高的突变率，也就是基因的异质性。Zhou 等[13]研究发现并确定了GVA 病毒的ORF5 为该病毒的致病因子，其致病性是ORF5 编码的P10 蛋白直接作用的结果，同时P10 还是一个弱的基因沉默抑制子。Haviv 等[14]研究表明，P10 的第8个氨基酸残基，分别是丙氨酸（Ala）和苏氨酸（Thr），会影响P10 的基因沉默抑制能力。

1.2 葡萄病毒B（GVB）

GVB 与葡萄皱木复合症同样有密切联系，在1997 年的第十二届国际葡萄病毒类病毒研究大会上将GVB 定为栓皮病的病原[15]。该病毒的草本寄主分别是本氏烟、西方烟和凯维科拉烟。GVB 的传播介体是粉蚧，分别是拟葡萄粉蚧和榕臀纹粉蚧。基因组为单分子线性RNA，长约7.6 kb。Hu 等[16]、李正男等[17]获得的GVB 中国分离物基因组分别长7 599、7 600 nt，Goszczynski[18]获得的GVB 全基因组序列总长为7 599～7 601 nt。GVB 基因组包括5个开放阅读框，ORF1 编码RdRp；ORF2 编码1个功能未知蛋白；ORF3 编码MP；ORF4 编码的是CP；ORF5 编码NABP，GVB 与GVA 的ORF5 产物功能类似，也有RNA 沉默抑制活性[18]。从NCBI 的GenBank 数据库可以检索到9 条GVB 的全长基因组序列，分为2 大组，第1 组共有2 条，分别来自中国、巴西，第2 组来自南非、加拿大、意大利和克罗地亚（图1）。

研究表明[16,19]，GVB 基因组同样具有广泛异质性。除ORF4 以外的所有开放阅读框的氨基酸序列都含有高度分化的区域，并且还发现ORF4 与ORF5之间还存在1个特别的基因区间，这可能是ORF5的启动子。前人研究[20-21]表明，GVB 与GVA 被分为纤毛病毒属（Trichovirus），最终发现与纤毛病毒属的苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）和马铃薯病毒T（PVT）在分子、生物学上存在差异，所以将GVA、GVB 重新归类为葡萄病毒属。

1.3 葡萄病毒D（GVD）

GVD 在土耳其首次报道[22]。目前在突尼斯共和国、巴西等国家也有该病毒发生的报道。感染了GVD 的葡萄表现为木栓状皱纹症状，但该病毒在皱木复合症中的具体作用仍不清楚，对于GVD 相关研究至今还较少[23-24]。该病毒基因组全长为7 479 nt，包括5个ORF，ORF1 编码RdRp，ORF2 编码假定蛋白，ORF3 编码MP，这3个ORF 序列在NCBI中找到，目前在其他文献中没有ORF1、ORF2、ORF3的基因序列的信息；ORF4 编码CP；ORF5 编码NABP。Fajardo 等[25]假设GVD 的ORF5 也有基因沉默抑制功能，但在后续并没有验证这一假设。根据NCBI GenBank 数据库报道，目前只有1 条GVD 的全基因组序列，来自克罗地亚（图1）。

1.4 葡萄病毒E（GVE）

GVE 在日本首次被发现[19,26]，在阿根廷和中国也有报道[27-28]，南非首次报道了GVE 的完整基因组序列[19]，发现GVE 的基因组结构与GVA 相似[20]。在华盛顿‘赤霞珠’葡萄样本中获得的GVE，全基因组序列长度为7 568 nt[20,29]，与其他侵染葡萄的葡萄病毒属成员相同，GVE 基因组共编码5个ORF。其中，ORF1 编码与病毒复制相关的蛋白，包括甲基转移酶（MTR）、解旋酶（HEL）和RdRp。在GVE 基因组序列中，解旋酶区域均包含1个2OG-Fe（Ⅱ）氧合酶结构域（AlKB），有研究表明，AlKB参与甲基化修复，对抗寄主的防御机制。根据NCBI GenBank 数据库报道，有5 条GVE 全基因组序列，分为2 大组，其中第1 组有2 条，分别来自南非和美国，第2 组来自日本、克罗地亚和中国（图1）。目前，GVE 是唯一被发现AlKB 位于解旋酶区域内部的植物病毒[24,30]。

1.5 葡萄病毒F（GVF）

伊朗第1 次报道了GVF[31]，GVF 的全基因组序列长为7 539 nt，ORF1 编码RdRp，ORF2、ORF3、ORF4、ORF5分别编码假定蛋白、MP、CP和NABP[32]，Fan 等[28]发现GVF 也与皱木复合症相关。目前关于GVF 的研究较少。根据NCBI GenBank 数据库的报道，共有3 条全基因组序列，第1 组的1 条来自南非，第2 组的2 条均来自美国（图1）。

1.6 葡萄病毒G（GVG）

GVG 在新西兰被发现，该病毒的基因组全长为7 496 nt，包含5个ORF，ORF1 编码的多聚蛋白包括4个识别域，分别为MTR、HEL、AlKB 及RdRp；ORF2 编码1个未知功能的蛋白；ORF3 编码病毒运动蛋白质结构域；ORF4 编码1个与ORF3 稍重叠的蛋白，且该蛋白具有识别毛状外壳蛋白结构域的功能；ORF5 是其中最短的1个ORF，编码病毒核酸结构域[33]。从 NCBI 的 GenBank 数据库可以检索到6 条GVG 的全长基因组序列，共分为2 大组，第1 组包括2 条，均来自克罗地亚，第2 组全部来自新西兰（图1）。通过GenBank 数据库基因库比对，该病毒与GVE、太匮龙舌兰叶病毒（ATLV）亲缘关系最近。

1.7 葡萄病毒H（GVH）

GVH 是在葡萄牙的1个无病症葡萄上发现的，全基因组序列长度为7 446 nt，编码5个ORF，基因组包含5′和3′非编码区，分别长97、85 nt，包含1个编码约20 kDa 大小功能未知的ORF2，而且与GenBank 数据库中任何蛋白都不相关；ORF1 编码195.1 kDa 的病毒复制酶，ORF1 与其相对应的秘鲁胡萝卜B 病毒（AVB）序列相似性是最高的，其次是GVB；ORF4 编码CP，与ORF4 亲缘关系最近的是GVD，其次是GVK；ORF3 编码1个29.2 kDa 的MP，经过序列比对，与GVA3 的CP 最相近；ORF5编码1个12.2 kDa 大小的NABP，具有基因沉默抑制能力，与薄荷病毒2（MV-2）的NABP 一致性最高[34]。根据NCBI 中GenBank 数据库报道，共有3条GVH 的全基因组序列，分为2 大组，其中1 条来自加拿大，2 条都是来自葡萄牙（图1）。

1.8 葡萄病毒I（GVI）

GVI 是在新西兰的‘霞多丽’葡萄球菌样本中鉴定出的。GVI 基因组全长为7 507 nt，与该病毒亲缘关系最近的是GVE，2种病毒在ORF1 和ORF4的比较中，氨基酸和核苷酸序列的一致性最高。GVI包括5个ORF，ORF1 编码多聚蛋白，包括MTR、HEL、AlKB 及RdRp 4个结构域；ORF2 编码1个与ORF1 稍重叠的假定蛋白；ORF3 编码1个包含病毒运动蛋白结构域的蛋白质；ORF4 与ORF3 重叠，并且编码1个包含毛状结构域的蛋白，该蛋白与ATLV 外壳蛋白的氨基酸序列一致性最高，其次是与GVE，最后是GVG；ORF5 编码1个NABP，而该蛋白与GVE 有最近的亲缘关系。由NCBI 的GenBank 数据库可知，有3 条GVI 全基因组序列,分为2 组，第1 组有2 条，来自新西兰，第2 组来自希腊（图1）。

研究表明，该病毒的复制酶基因结构显示了AlKB 的位置改变，虽然氧合酶蛋白广泛存在于细胞有机体内，但只在感染多年生寄主的病毒中发现，它们的作用可能是防止甲基化损伤[30]。

1.9 葡萄病毒J（GVJ）

GVJ 是在土库曼斯坦的一个白葡萄品种‘Kizil Sapak’上检测出来的。该病毒全基因组长度为7 390 nt，同样包含5个ORF 以及5′和3′非编码区，ORF1编码大小为194.6 kDa 的蛋白质，与GVA 的ORF1氨基酸序列有最高一致性，其中包括以下结构域：MTR、AlKB、HEL 以及RdRp；ORF2 编码1个功能未知的蛋白结构；ORF3 编码MP，并与GVA 的CP 氨基酸序列一致性表现出最高；ORF4 编码大小为21.7 kDa 的CP，与GVD 的CP 显示出的氨基酸序列一致性是最高的；最后，ORF5 编码的NABP，与病毒中存在RNA 结合蛋白相似[35]。根据系统进化树显示，该病毒与GVD 具有最近亲缘关系，其次是GVK。根据NCBI 的GenBank 数据库报道，共有2 条GVJ 全基因组序列，均来自土库曼斯坦（图1）。

1.10 葡萄病毒K（GVK）

GVK 是一种新发现的正义单链RNA 病毒，全基因组序列长为7 476 nt，包含5′和3′非翻译区，分别长80、77 nt。该病毒同样包括5个ORF，ORF1编码RdRp；ORF2 编码1个功能未知的蛋白质；ORF3 编码的是MP；ORF4 编码CP；ORF5 编码NABP。通过BLASTp（protein BLAST）搜索发现，GVK 的ORF1 与GVA 同源，ORF3 和ORF4 与GVA和GVD 的序列相似，ORF5 的序列与GVD 相似[36]。有研究表明，GVK 是GVD 的变种[33]。根据NCBI的GenBank 数据库报道，目前只有1 条来自克罗地亚的GVK 全基因组序列（图1）。

1.11 葡萄病毒L（GVL）

GVL 的全基因组序列长为7 607 nt，同样包括5个典型的ORF。通过对不同国家[37]不同品种的葡萄样品检测结果表明，所鉴定的病毒分布较为广泛且种类繁多。但GVL 的生物学特性仍然不清楚。ORF1编码RdRp，与GVE 的复制酶蛋白序列相似性最高；ORF2 与ORF1 重叠并编码1个功能未知的富含亮氨酸的蛋白质，并且是检测出的病毒中差异最大的蛋白质，所以该作者猜测这种重叠可能是终止-启动的信号，该病毒的ORF2 与GVE 的ORF2 编码的假设蛋白有44%的相似性；ORF3 编码MP，具有病毒运动蛋白结构域；ORF4 与ORF3 部分重叠，编码CP，是具有一个毛状病毒外壳蛋白的结构域，该病毒的CP 与GVE 的CP 具有78.4%的相似性；ORF5编码NABP[38]。目前NCBI 的GenBank 数据库报道，有4 条GVL 全基因组序列，共分为2 组，第1 组有2 条，分别来自中国和克罗地亚，第2 组有2 条都是来自美国（图1）。

1.12 葡萄病毒M（GVM）

GVM 是在美国德克萨斯州的杂交品种‘白布娃’中发现的，是一种新型病毒，该病毒全基因组序列长为7 387 nt，包括5个ORF，ORF1 编码RdRp，与GVH 的复制相关蛋白有最高的核苷酸序列一致性和氨基酸序列同源性；ORF2 编码功能未知的假定蛋白，与GVH 的ORF2 分别有55%核苷酸序列一致性、65.6%的氨基酸序列同源性；ORF3 编码MP，与GVH 的MP 分别有70.2%核苷酸序列一致性和69.7%的氨基酸序列一致性；ORF4 编码CP，与GVH 的CP 具有最高核苷酸序列一致性和氨基酸序列一致性；ORF5 编码的是NABP，与GVH 的NABP 也具有最高核苷酸序列一致性和氨基酸序列一致性[39]。综上所述得出与其最近的亲缘关系是GVH。根据NCBI 报道，目前只有1 条来自美国的GVM 的全基因组序列（图1）。

2 小结与展望

综上所述，我们对12种侵染葡萄的葡萄属病毒进行了综述，这是我国首次对该类病毒从生物学特性、分子特征和致病机制3个方面进行综述，并且基于全长基因组序列对上述12种病毒进行了系统发育分析，明确了12种病毒间的系统发育关系，为后续开展该类病毒的分子变异、流行、致病机制研究奠定了基础数据。

目前为止，大量研究证明，GVA、GVB、GVD、GVE、GVF 与皱木复合病的发生相关，但是这些研究仅限于生物学的嫁接试验，基于侵染性克隆单毒源的接种证明还未见报道。上述病毒中目前只有GVA 和GVB 侵染性克隆成功构建[2]，其他病毒均未见有成功构建侵染性克隆的报道，极大地限制了这些病毒致病机制的研究进展，因此，在后续研究中，开展上述病毒侵染性克隆的构建是进行病毒致病机制研究的关键。

到目前为止，GVA、GVB、GVE 可通过粉蚧传播，因此防控这类病毒病防虫是关键，同时，对于果树病毒病的防控，使用脱毒苗木是最好的防控办法，因此，建议在葡萄生产中尽量使用脱毒苗木[40]。本文提供的基因组信息，也为从分子水平开展病毒检测提供了基础数据，因此，未来对于侵染葡萄的葡萄病毒防控主要将从高灵敏的检测方法、使用脱毒苗木以及加强种植后田间粉蚧防控着手，同时建议加强其他传毒介体的调查。