罗忠国 李冬梅 张欢 曹玉清 汪航 徐雄

现如今，天然色素绝大部分都是从植物中所提取的，但由于受到提取工艺复杂等相关因素的制约，导致提取数量较少。通过微生物资源生产天然色素，能够有效克服上述不足之处，同时也易于工业化。本实验通过对92个黑木耳菌株进行培养，成功获得1株菌株（红褐色），将其中的色素进行提取，并通过一系列的实验来研究对色素稳定性造成的影响。结果显示，这一色素的最大吸收峰为304nm，且不溶于乙醚；光对色素稳定性也没有造成较大影响，具有相对较高的耐高温性能，抗氧化还原性相对较强。

一、材料与方法

1.供试菌株。选取不同地区的92个黑木耳菌株。

2.培养基。（1）PDA固体培养基（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，pH自然。（2）PDA液体培养基（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20，pH自然。

3.产天然色素黑木耳菌株的筛选。将100mL的PDA液体培养基置于容量为250mL的三角瓶当中，再将所有菌株分批接种到三角瓶中，在30℃、200r/min的条件下进行摇瓶发酵培养，对发酵液当中的颜色变化进行记录与观察，筛选出能够产生天然色素的菌株。

4.提取与纯化。（1）提取。将100mL的PDA培养基加入容量为250mL的三角瓶中，再在三角瓶中接入四个单位菌块，然后在30℃、200r/min的条件下摇晃培养8日。发酵液以10000r/min离心15分钟，将菌体完全去除，取上清液，采用7mol/L的HCL将pH调整到2.0，摇晃均匀，静置2小时。将上述液体以10000r/min离心15分钟，弃上清液进行烘干，所得到的即为色素粗提物。（2）纯化。在色素粗提物中加入5mL浓度为7mol/L的HCL，充分摇晃均匀，沸水浴2小时，沉淀采用1mol/L的KOH进行溶解，之后采用7mol/L的HCL将pH值调整到2.0。将上述液体以10000r/min离心15分钟，沉淀采用0.01mol/L的HCL和蒸馏水依次进行洗涤，再以10000r/min离心20分钟，在冷冻干燥机中干燥24小时以后，置于-20℃的条件下进行保存。

5.色素的溶解性。（1）有机溶剂的溶解性。称取4份色素提取物样品，每份5mg，分别加入装有丙酮、乙醇、乙醚、甲醇的试管中，轻轻摇晃，30分钟以后对溶解情况进行观察。（2）水溶液的溶解性。称取3份色素提取物样品，每份5mg，分别加入装有蒸馏水、0.1mol/L的HCL、0.1mol/L的KOH溶液的试管当中，充分摇晃均匀，30分钟以后对溶解情况进行观察；然后将试管放置在80℃当中水浴20分钟，对溶解情况进行密切观察。

二、结果与分析

1.产天然色素黑木耳菌株的筛选结果。在92株黑木耳中，一共筛选出2株可以产生色素的菌株，其发酵液当中的颜色发生一系列变化。其中2株所形成的色素会让发酵液呈现为红褐色，分别为Aua7以及Aua09；其余菌株的发酵液随着营养物质被充分吸收与利用，其色泽逐渐变得清透，但颜色没有任何明显变化。对比筛选出的2株黑木耳，Aua09所出现的颜色相对较深，其发酵液的颜色呈红褐色，色泽光亮，与红酒的颜色较为相似；所提到的粉末状色素粗产品的颜色也没有发生明显变化，仍为红褐色，同时色素产生相对较快，在4-6天左右。因此，本次实验主要的研究材料选定为Aua09。

2.色素的溶解性。此色素易溶于碱性溶液。在酸性条件之下，色素溶解程度随着pH的降低而不断减少，当pH降至2以下时，色素几乎完全沉淀。在碱性条件下，随着pH的不断升高，其溶液颜色会逐渐变深。色素能够溶于丙酮、甲醇以及乙醇，但溶解性不明显；溶解程度最大的是甲醇，其次为乙醇，最后为丙酮，但并不溶于乙醚。

3.色素的光谱特点。（1）色素的紫外可见吸收光谱。称取色素5mg，溶解以后加入蒸馏水补足到10mL，采取UV-1800型紫外可见分光光度计进行光谱扫描。参照物为蒸馏水，选取扫描的波长为300-360nm，色素的吸收峰值最高为304nm。（2）色素的红外吸收光谱。称取色素2mg，加入200mg的KBr，干燥处理后混合研磨成粉状，再压成透明薄片，400-4000cm-1扫描，在3432.68cm-1发生吸收峰是由于-OH和-NH2的伸展振动所致。

4.色素的稳定性。（1）温度对色素稳定性的影响。实验结果显示，在同一温度之下，随着水浴时间的进一步延长，色素溶液当中的吸光度不断增加；水浴时间相同，温度越高，则吸光度就越大。然而在室温之下放置的色素溶液，在8小时当中的吸光度始终保持不变，这表明色素的热稳定性较好。（2）光对色素稳定性的影响。将色素样品放置在3000Lx的光照强度下分别进行照射，结果显示，随着光照时间的不断增加，色素溶液的吸光度虽然呈现下降趋势，但相对较为稳定，不过也不宜长时间在强光之下进行照射。（3）pH对色素稳定性的影响。随着pH的进一步升高，OD值也呈现明显升高的趋势；当pH=2时，色素从红褐色转变为黄棕色，同时有沉淀析出。这说明酸性越强，溶解度越低。

三、讨论

随着我国社会经济的不断发展，人们的生活水平日益提高，对于食品当中应用的合成色素是否对人体造成危害也提出了质疑。另外，根据相关报道表明，绝大部分的合成色素没有办法向人类提供所必需的营养物质，部分合成色素甚至有可能对人体健康造成较大危害。天然色素具有色泽自然、安全以及无毒的优势，所以，对天然食用色素的开发是未来发展的趋势。

黑木耳是一种营养丰富和药用价值相对较高的食用真菌，本实验利用黑木耳发酵生产天然色素，并从多个方面对该色素的稳定性进行研究。结果显示，该色素的热稳定性相对较好，光稳定性也较好，然而不宜在强光之下长期暴露，在碱性条件之下色素颜色进一步加深，这表明该色素能够应用在热加工的食品当中。另外，黑木耳的原材料容易得到，提取方式簡便，生产周期相对较短，安全且无毒性，值得进一步开发与应用。该色素的外观呈红褐色，对其化学结构、药理作用等也有必要进行更加深入的研究。

作者简介：罗忠国（1982-），男，工程师；主要研究方向：天然色素的开发及应用、饮料的研发。

*通讯作者：李冬梅（1984-），女，工程师；主要研究方向：天然色素的研发及应用。