尤庆航, 彭 湃, 宋雨桐, 方 楠, 朱宗利, 侯新港,梁 爽, 逯忠斌, 曲 彤, 侯志广*,

(1. 吉林农业大学 植物保护学院，长春 130118；2. 吉林农业大学 资源与环境学院，长春 130118)

人参Panax ginsengC. A. Mey为五加科多年生草本植物，现代医学证明，人参及其制品能促进新陈代谢，调节生理机能，对治疗心血管疾病、胃病和肝脏疾病、糖尿病、不同类型的神经衰弱症等均有较好疗效[1-4]，其皂苷除药用制成人参茶以外，还在食品和化妆品的生产等方面均有较好的应用前景[5]。人参是一种宿根性药用植物[6]，自然界的土壤条件，大多不符合获得优质高产参根的要求，因此，多数参区都是选择适宜的天然林地，伐木整地后进行栽培。而我国林地面积较少，为保护森林资源，防止水土流失，近年来中国已逐渐从林下栽参转向农田栽参。与林地相比，农田草害更为严重，严重影响人参产量。但目前尚未见除草剂在人参上的登记，因此选用高效、低毒、低残留的除草剂来防除参地杂草具有十分重要的现实意义。

仲丁灵 (butralin) 是一种二硝基苯胺类芽前土壤处理除草剂，具有触杀兼局部内吸的作用，药剂可通过植物的根茎和幼芽吸收，在植物体内抑制分生组织细胞的分裂和分化，从而达到阻碍杂草的生长使其死亡的目的[7]。因其除草范围广，且低毒、低残留、安全性高，所以近年来仲丁灵越来越多的作为选择性芽前除草剂被应用于防除一年生禾本科杂草及部分阔叶杂草[8]。根据田间药效试验资料，仲丁灵在人参田防除杂草的药效较好，但不恰当的使用会让未被利用的农药迁移到土壤中，被人参根系吸收并转运到其他部位富集积累，进而影响食用者健康。因此，检测人参及其土壤中仲丁灵的残留量十分必要。

在GB 2763—2019[9]中，仲丁灵的残留物定义为仲丁灵母体，与仲丁灵结构相似且同为二硝基苯胺类除草剂的二甲戊灵的膳食摄入评估和MRL监测的残留物定义均定为二甲戊灵母体[10]。本文以此作为参考，将残留检测物暂定为仲丁灵母体。目前，关于仲丁灵的残留检测多集中在烟草[11]、土壤[12]、大豆[13]、水果[14]、水稻[15]等作物上，检测方法主要有配备电子捕获检测器的气相色谱法 (GC-NPD)[16]、气相色谱-串联质谱法 (GCMS/MS)[17]、高效液相色谱法 (HPLC)[18]和高效液相色谱-串联质谱法 (HPLC-MS/MS)[19]。截至目前尚未见有关仲丁灵在人参及其土壤中残留动态的相关报道。由于人参中含有皂苷、挥发油、酚类、氨基酸、有机酸、维生素、脂肪和甾醇等多种成分，致使基质较为复杂，当农药理化性质不稳定或目标分析物浓度过低时，复杂基质会对人参中农药残留检测造成困难[20]。与传统分析手段相比，HPLC-MS/MS对于复杂基质中痕量化合物的检测适用性更强[21]。鉴于此，本研究建立了一种快捷简便的HPLC-MS/MS测定鲜人参、干人参、人参植株及人参土壤中仲丁灵残留量的分析方法。此外，还通过1年4地的田间试验，研究了仲丁灵在人参及其土壤中的消解动态和最终残留量。旨在指导农民合理施药，保障仲丁灵在人参上的安全使用，为我国仲丁灵在人参中最大残留限量标准的制定以及仲丁灵在人参上的登记使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、药剂与试剂

Agilent 1260-6470高效液相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司)；T25 ULTRA-TURRAX匀浆机 (德国IKA集团)；SHZ-88水浴恒温振荡器(金坛市医疗仪器厂)；RV 10旋转蒸发仪 (德国IKA集团)；LE204E万分之一天平 (上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。

仲丁灵 (butralin) 标准品 (纯度98.7%，Dr.Ehrenstorfer公司)；48%仲丁灵乳油 (EC，大弓农化有限公司)；乙腈 (色谱纯，MREDA公司)；甲醇 (色谱纯，MREDA公司)；甲酸 (色谱级，福晨化学试剂有限公司)；乙酸铵 (色谱级，Sigma-Alorich集团)；氯化钠 (分析纯，北京化工厂)；水(杭州娃哈哈集团有限公司)；1 g NH2固相萃取柱(Agilent公司)。

1.2 田间试验

根据《农作物中农药残留试验准则》[22]进行。于2019年在吉林省白山市、抚松县、延吉市以及辽宁省桓仁县进行1年4地的田间试验，供试药剂为48%仲丁灵乳油 (推荐剂量为制剂量3 750 g/hm2)，供试人参Panax ginsengC. A. Mey品种为大马牙。

1.2.1 消解动态试验 选择栽有人参的土壤进行，小区面积50 m2，施药剂量以制剂量3 750 g/ hm2(有效成分1 800 g/hm2) 于人参出苗前通过土壤喷雾施药1次。分别于施药后0 (2 h)、1、3、7、14、20、30、45和60 d、收获期采集深度0～10 cm土壤样品；施药后，待人参植株生长至15 cm高时，分别于0 (2 h)、1、3、7、14、20、30、45、60 d及收获期采集人参茎叶。上述样品均于 −20 ℃下储藏，待测。

1.2.2 最终残留试验 施药剂量以制剂量3 750 g/ hm2(有效成分1 800 g/hm2) 于人参出苗前喷雾施药1次，小区面积为50 m2。于收获期分别采集人参(地下肉质根部分)、人参茎叶、人参土壤样品。于−20 ℃下储藏，待测。另设清水空白对照，处理间设保护带。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品的制备 称取500 g于 −20 ℃下保存的人参，经切片机切片后，一部分用食品加工机捣碎，混匀，制得鲜人参样品，于 −20 ℃保存；另一部分根据GB/T 19506—2009[23]方法置于80 ℃烘箱中烘干24 h，用粉碎机粉碎，过筛孔直径为180 μm 筛，制得干人参样品，于 −20 ℃保存。

1.3.2 提取 称取鲜人参样品和人参植株样品各20.0 g，分别置于250 mL烧杯中，加入100 mLV(乙腈) :V(水)=8 : 2混合溶液，高速匀浆约2 min，在铺有助滤剂的布氏漏斗中减压抽滤。将滤液全部收集于装有5～7 g氯化钠的具塞量筒中，振摇150次，静置1 min；再次振摇100次，静置1 h以上。取上清液待净化。

称取干人参样品5.0 g和种植人参土壤样品20.0 g，分别置于250 mL具塞三角瓶中，加入50 mLV(乙腈) :V(水)=8 : 2混合溶液，振荡提取1 h。后续抽滤等处理同鲜人参样品的处理。取上清液待净化。

1.3.3 净化 移取20 mL上述提取液于250 mL平底烧瓶中，于40 ℃水浴下旋转蒸发至近干，加入2 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液溶解，向NH2固相萃取柱中加入4 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液预淋洗，弃去流出液。当液面下降到柱填充物顶部时，将样品溶解液转移到净化柱上，并用新平底烧瓶接收，再用2 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液分别洗涤试样烧瓶3次，转移到净化柱中，最后用20 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液洗脱；收集全部洗脱液，于40 ℃水浴中旋转蒸发至近干，用氮气吹干，加入5 mLV(乙腈) :V(水)=3 : 2混合溶液复溶，混匀，过0.22 μm滤膜，待测。

1.4 仪器检测条件

色谱条件：Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色谱柱 (3.0 mm × 50 mm，1.8 μm)；流动相为V(甲醇)和V[(0.1%甲酸 + 5 mmol/L甲酸铵) 水溶液]=8 : 2，等度洗脱；流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量为5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源正离子扫描模式(ESI+)；多反应监测 (MRM)；毛细管电压4 000 V；雾化气为氮气，雾化气压力为0.207 MPa；干燥气温度330 ℃，干燥气流速为7 L/min；鞘气温度300 ℃；鞘气流速8 L/min。质谱参数如表1。

表1 仲丁灵的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of butralin

1.5 标准溶液配制与基质匹配标准曲线绘制

准确称取仲丁灵标准品0.01 g (精确至0.000 1 g)，先用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准母液，再用乙腈稀释，制备100 mg/L的标准溶液，于4 ℃贮存，备用。使用时用乙腈稀释成0.2、1和10 mg/L的系列仲丁灵标准工作液。

取空白基质样品按1.3节的方法进行样品前处理，添加仲丁灵标准溶液，配成质量浓度为0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 mg/L系列的基质匹配标准溶液。按1.4节条件测定，以仲丁灵质量浓度 (x) 为横坐标，峰面积 (y) 为纵坐标，绘制标准曲线，建立线性回归方程。

1.6 基质效应

在HPLC-MS/MS分析过程中，电喷雾电离源(ESI) 易受样品中分析目标化合物以外的基质成分和目标化合物在离子化过程中相互竞争的影响，从而产生基质效应[24]，影响HPLC-MS/MS在定量分析中的准确性与重现性[25]，因此本研究分别用空白溶剂和空白基质提取溶液配制一系列浓度梯度的标准溶液，在相同的色谱条件下检测，根据标准溶液的校正曲线斜率按公式 (1)分别计算鲜人参、干人参、人参植株和人参土壤中的基质效应。

式中Smatrix为基质空白提取液制备的标准曲线的斜率，Ssolvent为空白溶剂乙腈制备的标准曲线的斜率。当Me值在0.8～1.2之间时，其基质效应可以忽略；当Me值大于1.2时表现为基质增强效应；当Me值小于0.8时表现为基质减弱效应[26]。

1.7 添加回收试验

称取不含仲丁灵的鲜人参样品20 g、干人参样品5 g、人参植株样品20 g和人参土壤样品20 g，按1.3节方法进行样品前处理。向空白基质中添加仲丁灵标准溶液，仲丁灵在鲜人参和干人参中添加水平为0.01、0.05、0.5 mg/kg，在人参植株和人参土壤中的添加水平为0.01、0.05、0.5、10 mg/kg。每个水平重复5次，按1.4节条件测定，计算添加回收率及相对标准偏差 (RSD)。

2 结果与分析

2.1 HPLC-MS/MS条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化 分别在ESI+和ESI−模式下以0.3 mL/min的流速直接注入1.0 mg/L仲丁灵标准溶液进行扫描。结果发现，在ESI+下获得了丰度较高的母离子[M+H+]离子峰，进一步优化二级质谱的条件来获得特征子离子，并从中选择两个离子丰度较强，响应值较高，干扰较小的两个离子作为其定性与定量的离子对m/z240.2/222.2。

2.1.2 色谱条件的优化 C18色谱柱对于大多数化合物分辨效果好，保留性强且在液相色谱仪中应用较为广泛，故选用了Eclipse Plus C18色谱柱(3.0 mm × 50 mm，1.8 μm)，并在甲醇相和水相体积比为8 : 2的等度洗脱条件下对仲丁灵在不同流动相条件下的响应值和峰型进行了观察，比较了甲醇-水 (含0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵)、甲醇-水 (含0.1%甲酸)、甲醇-水 (含5 mmol/L氢氧化铵) 和甲醇-水4种流动相组合。由图1表明：当有机相为甲醇溶液，水相为含有0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸铵的水溶液时，仲丁灵的响应值最高，峰型较为尖锐，故选用甲醇-水 (含0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵) 作为流动相，在此条件下仲丁灵的保留时间约为5.4 min。

2.2 方法的线性关系和基质效应

结果 (表2) 显示，在0.002～0.5 mg/L内，不同基质中，仲丁灵的质量浓度与响应值有良好的线性关系。

表2 仲丁灵在人参中的线性方程及基质效应Table 2 Linear equations and matrix effects of butralin in ginseng

仲丁灵在鲜人参、干人参、人参植株和人参土壤中的Me值均大于1.2，表现为基质增强效应，为保证分析方法的准确性，采用基制匹配标准溶液校正样品，结果表明可以达到残留分析检测的要求[22]。

2.3 方法的准确度和精密度

结果 (表3) 表明：仲丁灵在鲜人参、干人参、人参植株和人参土壤中的平均回收率分别为98%～108%、93%～98%、94%～106%和95%～107%，相对标准偏差分别为1.4%～2.5%、0.6%～6.2%、1.2%～2.5%和0.80%～5.7%。仲丁灵的定量限 (LOQ) 为0.01 mg/kg。其准确度和精密度均满足农药残留定量分析的要求[22]。

表3 仲丁灵在人参及人参土壤中的添加回收率和相对标准偏差Table 3 Recoveries and RSDs of butralin in ginseng and ginseng soil

2.4 仲丁灵在人参中的消解动态

2019年在吉林省白山市和辽宁省桓仁县的田间消解动态结果显示，48%仲丁灵乳油在人参中的消解动态均符合一级反应动力学方程 (图2)。由表4可知，施药后随着采收间隔期的延长，仲丁灵在人参土壤及人参植株中的残留量均逐渐降低。施药60 d后，白山试验点人参土壤样品中仲丁灵的残留量为0.32 mg/kg，消解率达到了87.3%；辽宁省桓仁试验点人参土壤样品中仲丁灵残留量为0.29 mg/kg，消解率达到78.6%。仲丁灵在吉林白山和辽宁桓仁的人参土壤样品中半衰期分别为12.63 d和 18.91 d，表明仲丁灵在人参土壤中降解较快，属于易降解农药 (t1/2< 30 d)。

表4 仲丁灵在人参植株及人参土壤中的消解动态Table 4 Dissipation dynamics of butralin in ginseng plant and ginseng soil

施药60 d后，白山试验点人参植株样品中仲丁灵的残留量为0.36 mg/kg，消解率达到了88.7%；辽宁桓仁试验点人参植株样品中仲丁灵的残留量为0.28 mg/kg，消解率达到了88.7%。仲丁灵在吉林白山和辽宁桓仁的人参植株样品中半衰期分别为11.80 d和 10.81 d。

徐月明等报道仲丁灵在土壤中的半衰期为9.04～11.17 d[27]，李义强等报道仲丁灵在烟叶中的半衰期为5.2～12.2 d[28]，本研究中仲丁灵在人参植株中的半衰期与其结果相近，但在人参土壤中的半衰期却相对较长，可能的原因是：一方面人参植株本身的生长发育状况和理化特性对仲丁灵的降解有一定的影响；另一方面，不同的气候条件、土壤中微生物的种类与数量、有机质的含量影响农药在土壤中降解[29]，也使得处于不同地理位置的试验点的半衰期有一定差异。

2.5 仲丁灵在人参中的最终残留量

2019年在吉林省延吉市、白山市、抚松县和辽宁省桓仁县进行的1年4地的最终残留试验结果 (表5) 表明，48%仲丁灵乳油在人参出苗前，以制剂量3 750 g/hm2(有效成分1 800 g/hm2) 施药1次，仲丁灵在鲜人参中的最终残留量为

表5 仲丁灵在人参及人参土壤中的最终残留量Table 5 Terminal residues of butralin in ginseng and ginseng soil

3 结论

建立了高效液相色谱-串联质谱测定鲜人参、干人参、人参植株及人参土壤中仲丁灵残留的分析方法。研究了仲丁灵在人参中的消解动态和最终残留量。该方法采用NH2固相萃取柱净化，鲜人参、干人参在0.01、0.05和0.5 mg/kg，人参植株和人参土壤在0.01、0.05、0.5和10 mg/kg添加水平下，仲丁灵的回收率为93%～108%，相对标准偏差为0.6%～6.2%，满足农药残留分析检测的要求。

2019年仲丁灵在人参中的消解动态和最终残留试验结果表明，仲丁灵在人参及其土壤中的半衰期为10.81～18.91 d，属于易降解农药 (t1/2<30 d)。收获期仲丁灵在鲜人参中的最终残留量为