李 琦, 于金萍, 郭文磊, 刘亦学*,, 张 惟

(1. 天津市植物保护研究所，天津 300381；2. 广东省农业科学院 植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640)

荠菜Capsella bursa-pastoris是十字花科荠菜属草本植物，在中国分布广泛，其适应性强、种子量大、竞争力强，成熟后易传播，可造成作物严重减产，是中国小麦种植区的主要恶性杂草之一[1-2]。近年来，随着气候及耕作制度的改变，荠菜已成为天津市冬小麦田主要优势杂草，严重影响小麦的产量与品质[3]。

乙酰乳酸合成酶 (acetolactate synthase，ALS，EC 4.1.3.18) 在植物体内主要催化亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸生物合成的第一阶段，以ALS作为靶标的除草剂可以通过抑制该酶的活性，使杂草无法合成上述3种氨基酸而死亡[4-6]。鉴于其低毒、高活性和高选择性的特点，ALS抑制剂类除草剂被长期用于防除麦田杂草，但由于此类除草剂作用位点单一，且长期大面积单一使用，导致其抗性问题十分严重[7]。截至2020年11月，全球已有165种杂草对ALS抑制剂类除草剂产生了抗性[8]。

杂草对除草剂的抗性机理一般分为靶标抗性(target site resistance) 和非靶标抗性 (non-target site resistance)。靶标抗性包括靶标酶的过量表达及其基因突变；非靶标抗性则包括杂草对除草剂解毒代谢能力的增强以及吸收转运量的减少等[9]。研究发现，多数杂草对ALS抑制剂类除草剂产生抗性的主要原因是由于ALS基因保守区中的一个或几个可变氨基酸被其他氨基酸替代所致，目前已经报道证实有8个ALS基因氨基酸位点的27种氨基酸替代类型与其抗性相关[10-11]。

双氟磺草胺 (florasulam) 是美国陶氏农业科学公司开发的一种三唑并嘧啶磺酰胺类 (triazolopyrimidines，TP) 除草剂，属于ALS抑制剂类，于2001年在我国正式获准登记，可防除小麦田大多数阔叶杂草。小麦是天津市重要的粮食作物之一，荠菜等阔叶杂草在天津市部分地区的小麦田发生危害较严重。近年来，天津市部分地区农户反映双氟磺草胺对小麦田荠菜防治效果较差，推测荠菜可能对双氟磺草胺产生了抗性，但其具体抗性水平、抗性机制尚不明确。为此，本研究在天津市静海区、武清区、宝坻区及蓟州区等荠菜发生严重区域的冬小麦田采集部分荠菜种群，测定了其对双氟磺草胺的敏感性，并扩增、比对了敏感和抗性种群的ALS基因片段，以期为荠菜的有效防除及除草剂的合理使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

杂草种子：于2018年6月，从天津市静海区、武清区、宝坻区及蓟州区等地冬小麦田采集荠菜Capsella bursa-pastoris种群共6个，分别编号为TJ01、TJ02、TJ03、TJ04、TJ05和TJ06；另从天津市农业科学院核心区内未使用过任何除草剂的非耕地采集1个荠菜种群，作为敏感对照，编号TJ12。采集地点等具体信息见表1。

表1 供试荠菜种群采集点信息Table 1 Location of C. bursa-pastoris populations collected

供试除草剂：50 g/L双氟磺草胺 (florasulam)悬浮剂 (SC)，天津市华宇农药有限公司。

生物试材：植物基因组DNA提取试剂盒，北京全式金生物技术有限公司。基因扩增引物由金唯智 (天津) 生物科技有限公司合成。

主要仪器：ASS-4型自动控制喷洒系统，北京盛恒天宝科技有限公司；5804R型台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；T100型PCR仪，美国Bio-Rad公司；DYY-8C型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；HDL洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；RXZ-280C植物培养箱，宁波江南仪器厂；GZX型电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 荠菜对双氟磺草胺的抗性水平测定 采用整株水平测定法[12]。从各荠菜种群中选取籽粒饱满均匀一致的种子，置于含2层滤纸的9 cm培养皿中，每皿加5 mL灭菌水保湿，将培养皿置于光照培养箱中催芽 (光周期：12 h/12 h；温度：20 ℃/15 ℃)。将15粒露白的荠菜种子均匀播种于直径12 cm的塑料盆内，置于可控温室中培养 (自然光照，温度20～35 ℃，相对湿度50%～70%)。待生长至2片真叶时间苗，每盆留长势基本一致的荠菜10株。

待长至3～4叶期，用ASS-4型自动控制喷洒系统进行茎叶喷雾。喷雾压力为0.275 MPa，喷液量450 L/hm2。根据预试验，设定双氟磺草胺的处理剂量 (有效成分用量) 分别为：抗性种群 (R)，0、0.06、0.3、1.5、7.5、37.5、187.5 g/hm2；敏感种群 (S)，0、0.012、0.06、0.3、1.5、7.5、37.5 g/hm2。每处理重复3次，试验共重复2次。喷药后21 d，剪取荠菜地上部分，于恒温干燥箱内75 ℃下烘干72 h，称量干重并记录。

1.2.2 荠菜ALS基因片段克隆 从荠菜抗性和敏感种群中分别随机选取20株进行基因组DNA提取。待荠菜生长至4叶期后，剪取单株幼嫩叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA。采用已报道的两对引物序列[13]：Forward 1(5′-ATTCGTCTCCCGATTTGC-3′)/Reverse 1 (5′-GCCCGACACCAGTGCTTAT-3′) 和Forward 2 (5′-GGTATCCCTGTTGCGAGTA-3′)/Reverse 2 (5′-GCATACAAAGACCGTTTA-3′)，用于荠菜ALS基因扩增，其扩增片段包含已报道与抗性相关的8个基因突变位点。PCR扩增反应体系总体积为25 μL，包括：1 μL基因组DNA模板，1 μL正向引物 (10 μmol/L)，1 μL反向引物 (10 μmol/L)，10 ×EasyTaqSuperMix 12.5 μL，9.5 μL无核酸酶水。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，34个循环；72 ℃终延伸10 min。反应结束后，取5 μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，将含目的条带的PCR扩增产物送金唯智 (天津) 生物科技有限公司进行测序。将测序所得序列在NCBI上与荠菜ALS基因进行BLAST比对，用DNAMAN 6.0.3软件对扩增所得敏感、抗性种群荠菜ALS基因进行比对分析。

1.2.3 数据处理 试验数据采用双逻辑非线性回归模型y=C+ {(D–C)/[1 + (x/GR50)b]} 拟合剂量反应曲线，计算出抑制50%荠菜生长所需的除草剂剂量 (GR50值)。式中：y为除草剂某一剂量下荠菜干重相对于空白对照的百分比；x为除草剂剂量；C为剂量反应下限；D为剂量反应上限；b为斜率。

抗性倍数 (resistance index，RI) 计算公式为：RI = GR50(TJ01-TJ06)/ GR50(TJ12)。式中，GR50(TJ01-TJ06)为抗性种群的GR50值，GR50(TJ12)为敏感种群的GR50值。参考Beckie等[14]的方法对抗性情况进行分级：RI < 2为敏感，2 ≤ RI < 5为低水平抗性，5 ≤RI ≤ 10为中等水平抗性，RI > 10为高水平抗性。

试验结果采用SPSS 20.0软件的ANOVA方法进行统计分析，运用SigmaPlot 12.5软件绘制剂量反应曲线。

2 结果与分析

2.1 不同荠菜种群对双氟磺草胺的抗性水平

整株水平测定结果 (表2) 表明，所采集的6个荠菜种群对双氟磺草胺都产生了高水平抗性，GR50值在5.7～23.6 g/hm2之间，与敏感种群TJ12相比，6个田间种群的抗性倍数在11.4～47.2之间。

表2 不同荠菜种群对双氟磺草胺的抗性水平Table 2 Resistance ratio of C. bursa-pastoris to florasulam

2.2 荠菜抗性和敏感种群ALS基因差异

以提取的荠菜敏感和抗性种群单株基因组DNA为模板对ALS基因片段进行扩增，得到的两条ALS基因序列拼接后长度为1 738 bp，与NCBI中荠菜ALS基因序列 (HQ880660.1) 的同源性达99%以上。扩增的ALS基因片段包含了所有已报道的ALS基因抗性突变位点。将抗性和敏感种群的ALS基因序列进行比对，结果显示：在产生抗性的6个荠菜种群中，所有单株的ALS氨基酸序列的第197位氨基酸密码子均由CCT突变为了TCT，从而导致脯氨酸 (Pro) 突变为丝氨酸(Ser) (表3)。对PCR产物测序结果进行比对分析，发现6个抗性种群中随机选取的120个单株所发生的突变都是杂合型突变 (即197位密码子为CCT/TCT)。

表3 荠菜抗性与敏感种群ALS基因序列比对分析Table 3 Sequence alignment and deduced amino acid of the resistant and susceptible C. bursa-pastoris populations

3 结论与讨论

通过整株水平测定发现，采自天津市冬小麦田的6个荠菜种群TJ01、TJ02、TJ03、TJ04、TJ05、TJ06均对双氟磺草胺产生了高水平抗性，其抗性倍数在11.4～47.2之间。连续重复使用单一作用机制的除草剂是导致杂草抗药性产生的重要原因[15]。据报道，ALS抑制剂类除草剂连续重复使用3～5年以上，就可导致杂草产生抗性[16]。本研究中，抗性种群采集地块皆有多年使用双氟磺草胺防治阔叶杂草的历史。此外，随意提高施药剂量、同一生产季度内多次施用具有相同作用机制的除草剂等不合理的施药方式也加剧了杂草抗药性的发生和传播[17]。据张乐乐[18]报道，荠菜种子位于土壤表层时最适宜萌发，随着埋藏深度增加其萌发率显著降低，当超过1.2 cm时，萌发将完全被抑制。因此，在小麦种植前对土壤进行适度深耕，可有效降低荠菜的危害。此外，合理选择不同作用机制的除草剂交替和混合使用也可以延缓杂草抗药性的发生和发展。

靶标酶基因突变是杂草对ALS抑制剂类除草剂产生抗性的重要机制。本研究中，产生抗性的6个荠菜种群植株的ALS基因都发生了Pro-197-Ser突变，已有报道表明，多种杂草因该突变产生了对ALS抑制剂类除草剂的抗性[14]，因此，Pro-197-Ser突变很可能是本研究中荠菜抗性种群对双氟磺草胺产生抗性的重要原因。Yu等[19]通过对ALS酶动力学的研究，发现Pro-197-Ser突变对ALS功能几乎没有影响，不会影响荠菜的正常生理过程，因此这可能是该突变形式在天津广泛存在的原因之一。张乐乐[18]报道，荠菜的ALS基因中含有2个拷贝，并且这2个拷贝均可发生抗性基因突变，这可能是导致目前天津发现的抗性种群突变都是杂合型突变的关键因素。

长期在同一区域使用相同类型的除草剂，对杂草产生高选择压，会加速其抗药性的发生和发展，而盲目用药又会进一步加剧抗药性的蔓延。本研究仅从整株水平测定和靶标基因突变分析的角度进行了研究，下一步还需针对有关靶标酶活性的测定、交互抗性、代谢酶等与抗性关联的其他问题进行深入地研究剖析。