梨黑斑病菌对五味子提取物的敏感性研究

2021-08-24高小宽纪君阳孙文文

现代农村科技 2021年9期

张眉高小宽纪君阳孙文文

（衡水学院河北衡水 053000）

黑斑病是影响我国梨产量及品质的主要病害之一，链格孢菌是导致梨感染黑斑病的主要源头[1]。梨树早期落叶和嫩梢枯死都可能是梨黑斑病菌导致的，而且梨黑斑病的发生会让果实提前掉落并且伴随着裂果现象，严重削弱树势，降低树体的生命力和抗病能力[2]。该病的潜伏侵染期在梨树的花期和幼果期，涉及时间较长，在果实的贮藏期间梨黑斑病仍存在并且不易控制和防范[3]。

近年防治梨黑斑病的研究很多，但是利用中药提取物对梨生长时期进行防治的做法很少，我国中草药资源较丰富，中草药中具有许多抗菌、抑菌、杀虫作用的成分，这些成分是自然存在的，一般易于降解，对环境积蓄毒性的可能性不大[4，5]。本试验通过中药提取物对梨叶片黑斑病病菌抑制效果进行研究，采用离体叶盘法测定五味子提取物对梨黑斑病菌的抑制效果，从而筛选出五味子提取物对梨叶片黑斑病抑制的最佳浓度及梨叶片最佳浸液时间，以此为五味子提取物防治梨叶片黑斑病提供数据基础，并为新型生物防治剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料制备

1.1.1 病原菌制备。采集患有梨黑斑病的病叶，用70%酒精进行表面擦拭消毒，无菌水冲洗后切取病健交界处组织，在无菌操作条件下移置到PDA平板上，于25℃保温培养，表面长出分生孢子后进行单孢分离，纯化后在PDA培养基上作为供试菌株在冰箱中保存待用。

1.1.2 五味子中药粗提取。分别对五味子叶进行粉碎，用80%乙醇进行提取，在摇床中以150 rpm，25℃振荡2 d，用离心机以3 500 r/min离心20 min，离心结束后取上清液进行旋转蒸发，然后用80%乙醇定容，最后将定容好的提取物容器进行编号放入4℃冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 PDA培养基的制备。首先用天平称量去皮的马铃薯200 g，将其切成小方形块，放入锅中，加无菌水1 000 ml，煮沸30 min。将纱布对折用于滤去马铃薯残渣，将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂15～20 g，边加边搅拌防止糊化，将琼脂加热熔化后加入葡萄糖20 g。待葡萄糖溶解后，加入适量的无菌水以补充加热过程中损失的水分，定容至1 000 ml。分装至250 ml三角瓶中，每瓶100 ml，包装完成后，在0.103 Mpa、121℃下，高压蒸汽灭菌20 min。

1.2.2 病原菌的扩大化培养。取实验室冰箱保存菌种，在超净工作台下进行菌种的扩大培养。首先用经灭菌的打孔器于菌板约2/3直径处钻取菌饼，将钻取的菌饼用接种针转移到PDA平板中心处，菌面朝下。置于光照培养箱中25℃培养，培养期间要定时观察，将有杂菌感染的平板进行处理，等待梨黑斑病菌菌落直径接近2/3培养皿直径时，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.3 离体抑菌试验。首先配制所需浓度溶液，配制的五味子叶片提取物质量浓度分别为50mg/L、100mg/L、250 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L、1 500 mg/L、2000 mg/L、4 000 mg/L，将配制好的五味子叶提取物溶液放置于4℃冰箱中保存备用。采用离体叶盘法测定梨黑斑病菌对五味子叶提取物的敏感性。从衡水学院校园采集叶龄相同的梨健康叶片，用自来水冲洗晾干，叶片正面朝上浸泡于上述不同处理药液及对照组中，每种处理液及对照按照0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h的不同时间浸泡，然后将叶盘上的药液用吸水纸吸干，叶背面朝上置于底部垫有用相同药液润湿的托盘内，每个叶盘上接种2个菌饼，每个处理3次重复，最后把托盘用保鲜膜罩好，保持湿润状态。设置对照。培养7 d观察结果。菌落生长直径采用十字交叉法测量，根据测量数据进行抑制率的计算。

1.2.4 离体抑菌实验数据处理。菌丝生长抑制率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100%。用SPSS15.0统计软件求出药剂毒力回归方程和EC50值。

1.3 发病情况调查。接种7 d后，根据叶盘发病面积，采用9级法记录病情。0级，无病斑；1级，病斑面积占整个叶片面积的5%以下；3级，病斑面积占整个叶片面积的5.1%～25.0%；5级，病斑面积占整个叶片面积的25.1%～50.0%；7级，病斑面积占整个叶片面积的50.1%～75.0%；9级，病斑面积占整个叶片面积的75.1%以上。根据下式计算各处理的病情指数。病情指数=Σ(各级发病叶盘数×相对极值)/(调查总叶盘数×9)；防治效果=[1-(处理叶盘病情指数/对照叶盘病情指数)]×100%。

2 结果与分析

2.1 不同浓度及时间对梨黑斑病菌菌丝生长的影响。不同浓度及时间对梨黑斑病菌的影响如表1所示，梨叶片浸液0.5 h时，在浓度为50 mg/L时抑制率极低，几乎没有抑制效果，但是随着浓度的升高抑制率随之升高，在各个浓度梯度之间，抑制率差异不显著。叶片浸液3 h、4 h时，在浓度为2 000 mg/L时抑制效果均最好，抑制率分别为49.04%、48.05%。叶片在不同浓度下的抑制率是随着浸泡时间延长而增加，当浸泡时间增至3 h时，无论哪个浓度药剂，抑制率均达到最高值。因而可得出，梨叶片在五味子提取液下最佳浸液时间及最佳浓度分别为3h、2000mg/L。

表1 不同浓度及时间对梨黑斑病菌的抑制率影响

2.2 药液对梨黑斑病菌的室内毒力测定。不同浓度药液及浸泡时间对梨叶黑斑病影响的相关毒力回归方程及EC50值、相关系数如表2所示。由数据可得，每个毒力回归方程的相关系数均大于0.916 683 443，说明离体叶盘保湿法具有较高的精密度。叶片浸液3 h的抑制作用最好，毒力最强，EC50为3 482.454 mg/L，相关系数为0.982 320 364。

表2 不同浓度药液浸泡时间对梨黑斑病菌的毒力测定结果

2.3 病情记录。通过9级法记录病情，病斑级数及患病叶盘数情况见表3，由数据得出，梨叶的病情指数均分布在1级和3级，病斑级数越大就证明梨叶受梨黑斑病菌的侵染越严重，在梨叶浸泡时间为4 h之前，随着浸液时间的延长，梨叶病斑级别为1级的叶盘数也在增长，这就代表着浸液时间的延长抑制了梨叶片上病斑的扩大，并且此现象跟抑菌效果有一定的联系，在叶片浸液时间为4 h时，其1级叶盘数量有所下降，3级叶盘数量增加。由此可得，在叶片浸泡时间为3 h时，抑菌效果最佳。

表3 使用9级法记录病情

2.4 病情指数及防治效果。由9级法得出的各级病斑，计算出各个时间段的处理叶盘病情指数及防治效果，如表4所示，叶片浸泡在对照组时，病情指数为33.33%，在叶片浸泡3 h时病情指数为最小值18.51%，较对照的病情指数下降了14.82%，并且防治效果最好，达到了44.4%，由此可看出，梨叶片浸液时间为3h时对梨叶期的梨黑斑病防治效果达到最佳。