陈俞洁，杨洲，高静媛，于晓龙，邢磊

(华北理工大学附属医院全科医学科，河北 唐山 063000)

0 引言

糖尿病肾病(Diabetic Nephrapathy，DN) 是糖尿病患者终末期最危险的微血管并发症之一，又称糖尿病肾小球硬化症，是世界范围内慢性肾脏病的最常见的原因，其发病率呈现逐年上升趋势[1]。目前，糖尿病肾病的确切病因尚不清楚，但各种推测的机制是：肾血流动力学异常、高血糖症、高血压、糖基化产物、细胞因子、遗传因素的激活等相互作用所导致[2]。红景天苷[3](4-羟基-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，Salidroside)，是红景天属植物中广泛存在的酚苷类化合物。红景天苷可增加血清胰岛素水平以及抗氧化酶活性，在一定程度上对糖尿病肾病起到了保护作用，但其具体机制不详，为进一步研究红景天苷在延缓糖尿病肾病中的作用机制，本次研究通过制备动物模型实验，用于研究红景天苷治疗糖尿病肾病的疗效观察。

1 材料

1.1 实验动物

选取清洁级健康SD大鼠，雄性，体重(250±50)g，共60只，购自中国解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究学所，许可证号：SCXK (军) 2009-003。

1.2 实验材料

全自动生化分析仪(日立7600系列)；红景天苷(salidroside，北京索来宝生命科学公司)；链脲佐菌(streptozotocin，STZ，Sigma公司)；多克隆兔抗鼠MMP-9(abcam 公司)、山羊抗兔IgG聚合物免疫组化试剂盒、DAB显色剂(中杉金桥)；高糖高脂饲料(普通鼠饲料加蔗糖、炼猪油和蛋黄按比例加工制成，其比例为猪油18%、蔗糖20%、蛋黄3%、基础饲料59%)。尿毒清颗粒以1:1比例溶于蒸馏水，加热至溶解，备用。用0.1mmol/L 无菌枸橼酸钠缓冲液(pH4.2，4℃) 将STZ配成2%的溶液，备用。

1.3 动物分组及处理

动物适应性喂养1周后，随机抽出10只为正常对照组(NC)，50只大鼠造模成功后，随机分成5组。每组每日上午灌胃给药1次，共8周。各组的设置及处理如下：

(1) 正常对照组(NC)：大白鼠10只，同剂量的腹腔注射生理盐水。

(2) 糖尿病肾病组(DN组)：模型鼠10 只，同剂量的腹腔注射生理盐水。

(3) 红景天苷低剂量组(SL)：模型鼠10 只，1g/kg。

(4) 红景天苷中剂量组(SM)：模型鼠10 只，2g/kg。

(5) 红景天高剂量组(SH)：模型鼠10 只，4g/kg。

(6) 尿毒清颗粒组(UCG组)：模型鼠9只，40 mg/kg

1.4 造模方法

50只大白鼠给予高糖高脂饲料喂养，禁食12 h，一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ，60mg/kg)。注药后72h后由尾静脉取血测空腹血糖(FPG)，连续3次随机血糖≥16.7mmol/L， 即糖尿病造模成功。继续饲养3周，检测24h尿微量白蛋白(mALB)>30mg/kg·d，即糖尿病肾病模型成功。本次实验1只大鼠尿蛋白未达标，即成模率96.3%。

1.5 检测方法

1.5.1 生化指标检测和标本采集

各组大鼠禁食12h，称量体质)BW)，经尾静脉采血，测量空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR；HOMAIR=FPG×FINS/22.5)，留取24h尿液测mALB。按照不同剂量红景天苷和尿毒清颗粒治疗8周后，禁食12h，称量各组大鼠体质，以10%水合氯醛 3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，经腹主动脉取血，检测FPG、FINS、BUN、Scr、mALB；分离并取出左肾，行生理盐水冲洗后沿横断面切割组织，分成大小为0.5cm×0.5cm×0.5cm，留置10%中性甲醛中固定。取已固定的肾组织装入包埋盒中，生理盐水冲洗过夜后，按梯度乙醇脱水，石蜡包埋、5um连续切片。其余组织放入-80℃中保存待检。

1.5.2 苏木素-伊红(HE)染色

石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，苏木素染色5min，1%盐酸乙醇分化5s，流水冲洗返蓝，伊红染色3min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性胶封片。HE染色切片制作完成后，于光学显微镜下观察肾小管上皮细胞变性、萎缩、肾间质纤维化等病变。

1.5.3 免疫组织化学显色

常规按免疫组化SP法进行。将载有石蜡切片的载玻片置于60℃恒温箱中烘烤15min，常规脱蜡5min、脱水3mim；PBS漂洗3次；高压抗原修复；3%内源性过氧化氢酶阻断剂50μL，孵育15min；加一抗(1:50)，PBS代替一抗进行染色作为对照，在4℃孵育过夜；PBS漂洗3次，每次3min；加入二抗IgG，37℃孵育60min；PBS漂洗3次，每次3min；DAB避光显色3min；空气干燥后中性树胶封片；每张切片随机选择20个不重叠视野，计数每个肾小球内MMP-9染色阳性(棕黄色)足细胞数量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 给药前后各组大鼠血糖及胰岛素比较

给药前，模型组和红景天苷药物组FPG、FINS、HOMAIR水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。给药8周后，组间FPG、FINS、HOMA-IR差异均具有统计学意义(P<0.05)，两两比较显示，各剂量的红景天苷药物组FPG、FINS、HOMAIR低于模型组，且SM组、SH组的FPG低于SL组及UGC组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血糖及胰岛素比较

2.2 给药前后各组大鼠肾功能及尿蛋白比较

给药前，模型组和红景天苷药物组BUN、Scr及24h mALB水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；给药8周后，组间BUN、 Scr及24h mALB水平差异均有统计学意义(P<0.05)。两两比较显示，模型组和红景天苷药物组BUN、 Scr及24h mALB均高于正常对照组，红景天苷药物组的BUN、 Scr及24h mALB低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，且SM组、SH组的FPG低于SL组及UGC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠BW及肾功能比较

2.3 各组大鼠肾组织病理学结果

对照组大鼠，肾小球、肾小管、肾间质结构正常，形态规整未见明显病理学改变(见图1-1)；模型组，系膜基质显著增多，伴随肾小球增生，基底膜变厚、增宽，肾小管扩张，肾小管区开始出现轻度纤维化，足细胞数量不多(见图1-2)；低剂量组(见图1-3)和中剂量组(见图1-4)肾组织病理损伤较DM组减轻，肾小球体积略有增大，基底膜未见明显增厚；高剂量组组(见图1-5)，足细胞个数多；且肾组织病理损伤明显减轻，但较对照组大鼠肾组织仍有损伤。

图1 大鼠大鼠HE染色镜下肾组织病理学改变

2.4 各组大鼠MMP-9的表达

显微镜下观察可见，MMP-9经免疫组化染色后显色为棕黄色，主要表达于肾小球及肾小管区域。模型对照组(见图2-2)与正常对照组(见图2-1)相比，大鼠肾组织MMP-9的表达明显下调；与模型对照组组相比，低、中、高剂量红景天苷组(见图2-3、图2-4、图2-5)的肾组织MMP-9的表达明显上调。经显微镜下观察，对照组MMP-9阳性足细胞数量为0.75±0.26个；模型对照组MMP-9阳性足细胞数量为3.78±0.29；低、中、高剂量红景天苷组MMP-9阳性足细胞数量分别为5.23±1.88、7.60±1.80、14.22±1.01个，呈逐渐增高趋势，且均高于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 各组大鼠免疫组织化学染色MMP-9的表达

3 讨论

糖尿病肾病发病初期主要是肾小球损伤所致的蛋白尿，后期发展成慢性肾功能衰竭主要是因为肾小管和肾间质的病变，即主要病理基础是肾间质纤维化。近年来，细胞外基质(extracellulaar matrix，ECM)的检测作为糖尿病肾病的早期预测指标日益受到重视，即糖尿病肾组织表现为细胞外基质重塑从而引发糖尿病肾病间质纤维化[4]。

生理状态下，在分泌合成细胞外基质的同时，系膜细胞可以降解分布在其中的金属蛋白酶，以避免细胞外基质过度聚集[5]；病理状态下细胞外基质的相互作用、过度沉积、分解减少和损伤是导致其代谢紊乱失衡的原因，且不断取代肾小球组织，造成肾小球硬化，这种由多因素控制的细胞外基质变化是导致肾组织纤维化的主要原因，最终促进糖尿病肾病的发展[6]。Tripathi YB等学者研究表明[7]MMP-9降低时，ECM处于病理堆积状态，从而导致糖尿病肾病的发展变化。因此，细胞外基质降解机制是研究重点。细胞外基质成分主要包括胶原蛋白、层粘连蛋白和弹性蛋白。细胞外基质属于胶原蛋白家族，主要含Ⅲ和IV型胶原蛋白。内皮细胞和足细胞位于基底膜细胞外基质结构，主要是由IV型胶原组成。细胞外基质的降解涉及4 种蛋白水解酶，在肾组织中活性较强的锌依赖性蛋白水解酶-金属蛋白酶(matrix metalloprotein，MMps)。MMP-9是MMps家族的成员，基因位于染色体20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13个外显子和9个内含子，主要功能是降解和重塑细胞外基质[8-10]，且当MMP-9基因启动子异常甲基化时，将可能导致糖尿病肾病细胞外基质代谢失衡[11]。研究表明，下调MMP-9的同时，上调金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMp-1)，以致MMP-9/TIMp-1比例失调，ECM降解减少，促进肾脏肥大及细胞外基质堆积[12]。Okada R等学者[13]研究发现在糖尿病肾病模型中，MMP-9在足细胞中高表达，且高塘环境可诱导体外培养的足细胞高表达MMP-9。本研究结果表明，当大鼠糖尿病肾病造模成功后，相较于模型组，红景天苷组的MMp-9的表达水平上调，且足细胞数目增加、相关生化指标FPG、FINS、BUN、 Scr、24h mALB均有不同程度的下降，说明红景天苷可延缓糖尿病肾病的发生发展。分析原因可能是红景天苷通过上调MMp-9的表达水平，从而使得MMp-9在体内特异性降解IV型胶原，分解细胞外基质成分，增加糖尿病肾病的足细胞数目，达到改善糖尿病肾病损伤的治疗作用。

红景天苷(salidroside) 是从红景天植物根、茎根中提取的主要有效酚苷类化合物，毒副作用比较小，现代药理学研究表明具有明显的抗氧化、降血糖、调血脂、预防骨质疏松等作用[14]。红景天苷可明显抑制大鼠肾小球基底膜增厚，从而参与肾脏局部的病理改变过程[15-16]。研究表明[17]红景天苷能够有效提高糖尿病大鼠胰岛素分泌，有效降低空腹血糖和血脂水平，增加体质量。朴敏虎等[18]将红景天苷干预治疗鼠糖尿病肾病模型，结果显示红景天苷能降低模型组的血糖、血尿素氮、肌酐、白介素-1β、肿瘤坏死因子-α 及肾组织的丙二醛水平，明显改善肾功能并发挥治疗作用。武凯良等[19]在60例患者研究中发现红景天苷不仅可以改善肾功能，而且可以影响糖尿病肾病患者血管内皮生长因子(VEGF)、热休克蛋白70(HSp70)的表达，起到抗氧化应激的作用。本次实验，相较于模型组和对照组，在红景天苷药物组作用下，糖尿病肾病的病理损害明显得到改善，与红景天苷的药理作用相一致。

本实验中发现，一方面，相对于糖尿病肾病模型组，给予红景天苷干预后，伴随MMp9表达水平的上升和足细胞数量上升，生化指标检测表明FPG、FINS、BUN、 Scr、24h mALB会有不同程度的下降，主要是在FPG、BUN、Scr水平上差异有统计学意义；另一方面，不同剂量的红景天苷组在FINS、mALB水平水平虽有差异，但差异无统计学意义。因此，说明此机制主要通过在降糖、降尿蛋白、改善大鼠胰岛素水平和肾功能的损害等方面延缓糖尿病肾病的发展，但未必有剂量依赖性。

因此，红景天苷通过上调MMP-9的表达水平可达到延缓糖尿病肾病进展。以后若从基因水平上分析MMP-9因子改变的根源，其作用机制将更加明确，便于更好地为临床应用提供有效的依据。