王敬文 严芳 柳浪 周雪平，2 王道文 周焕斌，5

（1. 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；2. 浙江大学农业与生物技术学院，杭州 310058； 3. 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物细胞与染色体工程国家重点实验室，北京 100101；4. 河南农业大学农学院，郑州 450002； 5. 农业农村部桂林作物有害生物科学观测实验站，桂林 541399）

植物基因功能和分子育种等研究的前提是突变体材料的获得。自然突变、人工诱变等方法存在效率低、周期长、难操作等缺点，因此，利用序列特异性核酸酶在特定基因位点产生 DNA 双链断裂、通过非同源末端连接和同源重组修复在靶基因位点引入突变的基因组编辑技术得到迅速发展。现有的基因编辑技术根据核酸酶的不同，主要包含锌指核酸酶（ZFNs）、类转录激活效应蛋白核酸酶（TALENs）和规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas），其中CRISPR/Cas系统具有操作简单、效率高、成本低等优点，受到广大研究人员的青睐。CRISPR/Cas来自原核生物（如细菌和古细菌）的免疫系统，可以选择性地靶向并破坏外源DNA，主要由Cas基因和CRISPR基因座（富含AT碱基的前导序列（leader）、涵盖回文序列的20-50 bp的重复序列（repeat）和从外源捕获的间隔序列（spacer）组成。基于Cas基因序列的差异、重复序列以及Cas簇的组成不同，Cas系统划分为2大类6种类型（I- VI）［1-3］。目前，应用较为广泛的 Cas9和Cas12系统都属于2类。

CRISPR/Cas9 作为研究最为广泛的基因编辑系统，仅需要由crRNA和tracrRNA组成的sgRNA和单体Cas9蛋白就能通过HNH和RuvC两大功能域实现对外源DNA 的切割［4］，已成功在人类细胞、果蝇、水稻、拟南芥、小麦等中实现基因编辑。……