胡严杰 龚世伟 任易

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)作为常用的一线抗结核药品[1-2]，能在吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase，PZase)的作用下生成吡嗪酸(pyrazinoic acid，POA)，中性条件下以POA-的形式存在，一部分POA-通过外排作用转运到细胞外，在酸性环境下，POA-被还原成不带电荷的POA分子。由于POA的动态平衡，不带电荷的分子再次被转运到细胞内，因为POA进入细胞时带一个质子，经过大量累积后使细胞质酸化，导致细菌死亡，从而发挥抗结核作用[3-5]。此外，PZA也可将治疗周期从9～12个月缩短至6个月[6]。因此，成为结核病短程化疗的基石。

PZase是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的pncA(561 bp)基因编码的蛋白，PZase编码基因及其启动子序列的突变是造成PZase活性降低或缺失的主要原因[7-8]，也是PZA耐药的主要原因。PZase编码基因及其启动子序列的突变形式包括点突变、插入和缺失，可能发生突变的碱基几乎覆盖了整个基因，因此不便于应用常用的基于探针杂交的分子检测技术。Surveyor酶是植物中提取的核酸内切酶，它可特异性切割DNA错配部位，无特异酶切核苷酸序列，并已用于MTB乙胺丁醇耐药基因突变的检测[9]。本研究采用核酸内切酶Surveyor酶切法测定MTB对PZA耐药性，并与BACTEC MGIT 960法检测结果和基因测序结果进行对比，评估该方法的临床应用价值。

材料和方法

一、菌株来源

MTB标准菌株H37Rv(ATCC27294)、PZA耐药的MTB标准株BCG(ATCC 34540)，以及91株(选取106株，最终复苏成功91株)耐多药MTB菌株均来自武汉市肺科医院。

二、 PCR扩增

50 μl PCR扩增体系包括25 μl Taq Master Mix(2×)，5 μl模板分别来自H37Rv、BCG或91株耐多药MTB临床分离株，其中H37Rv扩增时上游引物∶下游引物分别为1∶1、5∶4、5∶3、5∶2；临床株扩增时上游引物∶下游引物分别为1∶1、4∶5、3∶5、2∶5，最后加dd H2O补足至50 μl。……