邓祥宜, 李池茜, 张涵池, 柯 奥, 鲍晓龙, 李继伟

(武汉设计工程学院 食品与生物科技学院，湖北 武汉 430205)

肠道微生物与宿主相互依存，参与了维生素合成、物质代谢和免疫过程，对动物生长发育和维持健康具有不可替代的作用[1-4]。宿主种类对肠道细菌群落组成有重要的选择作用，进而造就了物种特异性的肠道菌群组成。仔猪肠道细菌优势门为厚壁菌门(Firmcutes)(49.03%)和拟杆菌门(Bacteroidetes)(31.94%)[5]；驴前肠细菌优势门为厚壁菌门(92.4%)，后肠为厚壁菌门(55.7%)和拟杆菌门(34.2%)[6]；凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物种类差异显著，前者的主要优势门为变形菌门(Proteobacteria)(占75.45%)，而后者的主要优势门为厚壁菌门(占49.74%)[7]。肠道菌群组成还受环境和饲喂方式的影响[8-9]，养殖环境对肠道菌群组成影响显著。虾蛤混养中，24%的肠道细菌种类在水体、沉积物中也同时存在，说明肠道微生物群落组成与养殖水体、沉积物密切相关[2]；不同脂肪源对卵形鲳鲹肠道微生物菌群有显著影响，豆油组和1∶1鱼油-玉米油组中优势菌门为软壁菌门，其他脂肪源组中优势菌门为变形菌门[10]。此外，有研究表明，健康和患病凡纳滨对虾的肠道菌群组成具有显著差异[11-13]，肠道菌群组成对宿主的健康状况具有较强的指示作用[14]。近年来，克氏原螯虾(Procambarusclarkii)(又称小龙虾)日益走红，中国已成为世界最大的小龙虾生产和消费国。根据中国小龙虾产业发展报告(2019)，2018年小龙虾产业总产值达3 690亿元，同比增长37.5%；养殖面积不断扩大，产量持续增加，2018年产量增幅为历年最高，达45.1%[15]。小龙虾养殖中，投种的存活率与养殖效益紧密相关[16]。前期实验发现，市售小龙虾(种虾、(30±5) g)大多食欲较差，在养殖2周内不断有死亡发生，最终(60 d养殖周期)存活率为3%～50%，而学校养殖塘捕捞的小龙虾(同等大小规格)摄食较多，在实验中的存活率接近100%。这种差异也被众多养殖专家和养殖户所重视，并在投种时采取就近购买、尽快投放的原则投放虾苗或种虾(成虾)。市售小龙虾与养殖塘小龙虾在摄食、存活率上存在显著差异，肠道菌群与其生长和维持健康密切相关，但两者的肠道菌群组成及功能是否存在差异尚不清楚。本研究以武汉设计工程学院养殖基地不同养殖塘的小龙虾和不同市场购买的小龙虾为材料，通过高通量测序研究其肠道细菌群落组成，并对优势细菌类群及群落功能进行比较，以期为评估小龙虾的健康状况、分析市售小龙虾摄食减少、存活率下降的原因和如何提高小龙虾投种成功率，以及开发小龙虾养殖专属微生态制剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 不同来源的小龙虾 用地笼从武汉设计工程学院养殖基地的两个不同实验塘捕获(用扶龙牌龙虾饲料投喂，养殖塘2个月内未使用任何微生物制剂或其他药物)，当天(2019年9月)取样，两个养殖塘样本分别记为C1、C2；从武汉白沙洲农副产品大市场、武汉新竹路市场购买小龙虾(2019年9月，产地均为湖北)运到实验室，分别暂养于洁净大塑料箱中(禁食，室温)，箱内仅加入约1 cm深的去离子水以保持虾体湿润，次日取样(淘汰明显受伤或活力不强的小龙虾，选取活动力强的小龙虾进行实验)，分别记为市售样本M1、M2。

1.1.2 主要试剂与仪器 土壤DNA快速提取试剂盒(FastDNA® SPIN Kit for Soil，美国MPbio公司)； DNA 聚合酶(TransStart FastpfuDNA polymerase，北京TransGen生物)； DNA凝胶回收试剂盒(AxyPrep，美国Axygen公司)。PCR仪(GeneAmp®9700，美国ABI公司)；蓝色荧光定量系统(QuantiFluorTM-ST ，美国Promega公司)；高通量测序平台(Illumina Miseq PE300，美国Illumina 公司)。

1.2 方法

1.2.1 取样 取不同来源小龙虾(鲜活、运动状况良好、(30±5) g/只)各10余只，去附肢后用75%酒精浸泡15 min，无菌水漂洗4次(每次5 min)，并用灭菌的湿棉球将虾尾部擦拭干净，拽拉尾部末端扯出整个肠道，用镊子将肠道内容物挤入灭菌的5 mL离心管中，把同一样本所有小龙虾的肠道内容物混合，于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2.2 细菌基因组DNA的提取及高通量测序 -80 ℃条件下取出虾肠道内容物，于冰上融化，用土壤DNA快速提取试剂盒提取总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，以NanoDrop 2000 测定DNA纯度和含量。以338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3′)为引物，通过PCR扩增16S rDNA V3～V4区序列。反应体系为20 μL：5×FastpfuBuffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer(5 μmol/L)0.8 μL、Reverse Primer(5 μmol/L)0.8 μL、FastpfuPolymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL、Template DNA 10 ng、补超纯水至20 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，27个循环；72 ℃ 10 min；10 ℃保存。PCR产物经电泳、回收、定量后进行Illumina Miseq测序[17]，测序公司为上海美吉生物医药科技有限公司(上海，中国)。

1.2.3 高通量测序结果分析 小龙虾肠道细菌高通量测序结果借助美吉生物云平台进行分析，主要流程：将测序原始序列进行拼接和质控，按样本进行OTU(操作分类单元)聚类分析，OTU分析使用Usearch平台(version 7.0, http://drive5.com/uparse/)，相似性在97%以上的序列聚为一类；选择OTU代表序列比对Silva数据库(Release132, http://www.arb-silva.de)进行物种分类学分析；在OTU水平进行Alpha多样性分析；基于分类学信息，在门、科水平上进行群落组成统计分析，在属水平绘制群落热图，根据物种、样本间丰度的相似性进行聚类，分析样本细菌群落组成相似情况以及主要差异属；利用PICRUSt软件包[17-18](version 1.1.0, http://picrust.github.io/picrust/)进行细菌群落功能分析，使用EggNOG(evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups，http://eggnog. embl.de/)数据库；使用R语言工具、Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 样本序列统计

小龙虾肠道细菌多样性的测序信息见表1。经质控、拼接，细菌16S rDNA序列V3～V4区共测得176 311条有效序列，平均长度423 bp；去除序列数小于20的OTU，并按最小序列数抽平处理[19]，每个样本获得抽平后的序列数为34 912条。

表1 样本信息和Alpha多样性指数

2.2 不同来源小龙虾肠道细菌群落Alpha多样性分析

小龙虾肠道细菌群落Alpha多样性指数见表1，Sobs、Ace和Chao1指数可显示群落物种的丰度，数值越大代表物种丰度越高；Shannon指数综合反映群落多样性，Shannon指数越大代表群落多样性越高；Coverage指数显示物种覆盖度，值越接近1(即100%)表明测序越全面，越能代表样品真实物种组成情况[20-21]。

表1中，所有样品测序的覆盖率(Coverage)指数均大于99.97%，同时样品稀释曲线趋于平缓(图1)，说明增加测序量只能发现极少量的物种，即测序结果能很好地反应小龙虾肠道样品中的细菌群落组成。市售样本(M1、M2)的Sobs、Ace和Chao1指数高于养殖塘样本(C1、C2)，显示市售样本的物种丰度更高；Shannon指数显示M2样本群落多样性最高，M1次之，C1、C2多样性相对较低(表1)。因此，养殖塘小龙虾肠道细菌群落丰度和多样性相对较低，而市售样本的细菌群落丰度和多样性相对较高，这可能与市售小龙虾养殖环境中的细菌群落有关，也可能是小龙虾在运输和销售过程中接触了不同种类的细菌所致。

2.3 不同来源小龙虾肠道细菌群落组成分析

在97%的相似水平上对小龙虾肠道细菌16S rDNA V3～V4区测序结果进行OTU分析，通过Venn图展示共有和独有的OTU数，结果见图 2。经前期去除序列数小于20的OTU和抽平处理，4个样本共测得130个OTUs，其中C1、C2、M1、M2样本依次测得69、64、110、95个OTUs；所有样本共有40个OTUs，远高于其他部分共有或独有OTUs，说明不同来源小龙虾肠道细菌种类具有较高的共性。

图1 样品稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of samples

图2 OTU水平Venn图Fig.2 Venn diagram on OTU level

2.3.1 细菌群落门水平组成 小龙虾肠道细菌群落门水平组成见图3，实验中共检出变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、暂定门RsaHF231、软壁菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)等9个门。养殖塘样本(C1、C2)优势门为变形菌门(占49.98%～58.11%)、厚壁菌门(9.51%～36.76%)、软壁菌门(6.02%～26.96%)和拟杆菌门(4.06%～4.14%)，暂定门RsaHF231和放线菌门只占1.17%～2.32%、0.15%～0.37%；市售样本(M1、M2)优势门为拟杆菌门(21.05%～39.22%)、厚壁菌门(20.51%～35.94%)、暂定门RsaHF231(11.55%～46.34%)和变形菌门(占4.29%～11.04%)，软壁菌门和放线菌门只占0.52%～5.27%、1.69%～1.71%。与养殖塘小龙虾相比，市售样本中变形菌门和软壁菌门相对较少，拟杆菌门和暂定门RsaHF231相对较多，厚壁菌门和放线菌门占比相当。

图3 细菌门水平相对丰度Fig.3 Relative abundance of bacteria on phylum level

2.3.2 细菌群落科水平组成 小龙虾肠道细菌群落科水平组成见图3，实验中共检出61个科的细菌。养殖塘样本(C1、C2)细菌主要分布在肠杆菌科(Enterobacteriaceae，44.36%～54.37%)、支原体科(Mycoplasmataceae，6.02%～26.96%)、梭菌科(Clostridiaceae，1.95%～33.27%)、拟杆菌科 (Bacteroidaceae，2.28%～2.50%)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae，1.25%～3.33%)、暂定门RsaHF231未分类科(1.17%～2.32%)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae，1.43%～1.85%)、肠球菌科(Enterococcaceae，0%～5.27%)、气单胞菌科(Aeromonadaceae，0.79%～1.14%)和Family_XⅢ科(0.13%～1.27%)等10个科；市售样本(M1、M2) 细菌主要分布在暂定门RsaHF231未分类科(11.55%～46.34%)、拟杆菌科 (Bacteroidaceae，18.23%～28.35%)、梭菌科(Clostridiaceae，0.34%～16.02%)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae，12.33%～12.36%)、Weeksellaceae科(0.19%～8.83%)、支原体科(Mycoplasmataceae，0.52%～4.81%)、Family_XⅢ科(2.44%～3.17%)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae，0.58%～2.88%)、Dysgonomonadaceae科(1.32%～2.63%)、红环菌科(Rhodocyclaceae，1.21%～1.48%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae，0.33%～1.87%)和希瓦氏菌科(Shewanellaceae，0.04%～1.69%)等12个科。对比以上数据可发现，养殖塘小龙虾肠道中肠杆菌科、支原体科细菌占比远高于市售样本，而市售样本中暂定门RsaHF231未分类科、拟杆菌科和丹毒丝菌科占比较高。

2.3.3 细菌群落属水平组成 小龙虾肠道细菌群落属水平组成见图5(群落属水平热图)。通过样品聚类分析发现，养殖塘样本C1、C2聚为一类，市售样本M1、M2聚为一类(图5)，说明C1、C2细菌群落组成相似(组内)，M1、M2群落组成相似(组内)，而养殖塘样本(C1、C2)与市售样本(M1、M2)细菌群落组成差异明显(组间)。因此，可认为养殖塘与市售小龙虾肠道细菌群落组成差异明显。将丰度前50的属进行聚类分析，找出养殖塘与市售样本细菌群落的主要差异属。市售样本中丰度相对较高的属见图5方框Ⅰ，包括暂定门RsaHF231未分类属、拟杆菌属(Bacteroides)、[Anaerorhabdus]_furcosa_group、g_ZOR0006、Weeksellaceae科未分类属；养殖塘样本中丰度相对较高的属见图5方框Ⅱ，包括柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia-Obesumbacterium)、支原体科暂定属(Candidatus_Bacilloplasma)、梭菌科未分类属、肠杆菌科未分类属、希万氏菌属(Shewanella)和肠球菌属(Enterococcus)。主要差异属的丰度及门水平、科水平分类信息见表2。从丰度上看，养殖塘样本中变形菌门肠杆菌科的柠檬酸杆菌属和哈夫尼菌属、软壁菌门支原体科的Candidatus_Bacilloplasma暂定属明显高于市售样本；市售样本中暂定门RsaHF231未分类属、拟杆菌门拟杆菌科的拟杆菌属、厚壁菌门丹毒丝菌科的[Anaerorhabdus]_furcosa_group和g_ZOR0006明显高于养殖塘样本。

图4 细菌科水平相对丰度Fig.4 Relative abundance of bacteria on family level

表2 样本属水平的主要丰度差异

图5 细菌群落属水平热图(top 50)Fig.5 The bacteria community heatmap on genus level (top 50)

2.4 养殖塘与市售小龙虾肠道细菌多样性差异分析

为了进一步评估各样本菌群组成差异，基于weighted-unifrac距离算法进行主坐标分析(PCoA)，结果见图6。第一主成分(PC1)解释度为75.62%，第二主成分(PC2)解释度为21.53%；养殖基地不同养殖塘样本(C1、C2)距离较近，与市售样本(M1、M2)距离较远；市售样本M1、M2在第一主成分上距离较近，在第二组成分上差异略大。因此，养殖塘与市售小龙虾的肠道菌群存在明显差异，这种差异大大超过了不同养殖塘之间或不同市场之间的差异。

2.5 功能预测分析

通过PICRUSt对16S rDNA测序结果进行细菌群落功能预测，获得对应的COG家族相对丰度，结果见图7。除去未知功能分类后，小龙虾肠道细菌群落功能中氨基酸转运及代谢、碳水化合物运输及代谢、能量产生与转换、无机离子转运和代谢、与复制/转录/翻译/细胞壁和膜合成相关功能等丰度较高。不同来源样本相比，养殖塘样本COG功能中的能量产生与转换、氨基酸转运及代谢、碳水化合物运输及代谢、无机离子转运和代谢、细胞运动等明显高于市售样本，而市售样本中核苷酸转运及代谢、与复制/翻译/细胞壁和膜合成相关功能、防御机制等的相对丰度明显高于养殖塘样本。因此，养殖塘小龙虾肠道细菌群落的代谢功能旺盛(相对丰度高)；市场样本代谢功能相对较弱，但与细菌繁殖、防御的相关功能较强，即市售样本细菌群落抗逆能力更强。

图6 细菌物种组成 PCoA 图(OTU 水平)Fig.6 PCoA diagram of bacterial OTU composition

图7 PICRUSt推断的细菌COG功能相对丰度Fig.7 Relative abundance of inferred bacterial COG functions by PICRUSt A：RNA加工和修饰；B：染色质结构和动态；C：能量产生与转换；D：细胞周期控制、分裂和染色体分配；E：氨基酸转运及代谢；F：核苷酸转运及代谢；G：碳水化合物运输及代谢；H：辅酶运输及代谢；I：脂类运输及代谢；J：翻译、核糖体结构及生物合成；K：转录；L：复制、重组和修复；M：细胞壁/膜生物合成；N：细胞运动；O：翻译后修饰、蛋白质降解及分子伴侣；P：无机离子转运和代谢；Q：次级代谢物合成、转运及分解；S：未知功能；T：信号转导机制；U：细胞内运输、分泌及囊泡运输；V：防御机制；W：细胞外结构；Z：细胞骨架 A:RNA processing and modification; B:Chromatin structure and dynamics; C:Energy production and conversion; D:Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; E:Amino acid transport and metabolism; F:Nucleotide transport and metabolism; G:Carbohydrate transport and metabolism; H:Coenzyme transport and metabolism; I:Lipid transport and metabolism; J:Translation, ribosomal structure and biogenesis; K:Transcription; L:Replication, recombination and repair; M:Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N:Cell motility; O:Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P:Inorganic ion transport and metabolism; Q:Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; S:Function unknown; T:Signal transduction mechanisms; U:Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V：Defense mechanisms; W:Extracellular structures; Z:Cytoskeleton

3 讨 论

本研究通过高通量测序研究了养殖塘和市售小龙虾肠道菌群多样性，所有样本共有OTU数远高于其他部分共有或独有OTU数，说明不同样本细菌种类有较高的共性；结合门、科水平群落组成结果可发现，不同样本的物种丰度存在明显差异。养殖塘小龙虾肠道菌群优势门为变形菌门(占49.98%～58.11%)、厚壁菌门(9.51%～36.76%)、软壁菌门(6.02%～26.96%)和拟杆菌门(4.06%～4.14%)。这与前人研究结果相似：Guo等[22]发现变形菌门、软壁菌门、拟杆菌门、厚壁菌门是小龙虾肠道细菌优势门；Zhang等[23-24]发现小龙虾肠道细菌优势门为变形菌门(70.70%～71.59%)、拟杆菌门(18.21%～20.26%)和厚壁菌门(3.01%～6.21%)。变形菌门和厚壁菌门也是罗氏沼虾肠道的核心菌群，而软壁菌门含量受环境影响较大[8]。本研究中，市售小龙虾肠道细菌群落主要优势门为拟杆菌门(21.05%～39.22%)、厚壁菌门(20.51%～35.94%)、暂定门RsaHF231(11.55%～46.34%)和变形菌门(4.29%～11.04%)，其中拟杆菌门和暂定门RsaHF231远高于养殖塘样本，而变形菌门(正常核心优势菌门)却远低于养殖塘样本。

群落热图和聚类分析可以展示不同样本群落组成的相似性以及主要差异种类。Chen等[25]在OTU水平上进行聚类分析，找出了与牙周疾病相关的口腔微生物类群和口腔正常菌群。本研究通过属水平群落热图、聚类分析和主坐标分析(PCoA)发现，养殖塘小龙虾肠道菌群组成与市售小龙虾之间的差异大大超过了组内差异；柠檬酸杆菌属和哈夫尼菌属是养殖塘小龙虾肠道的正常核心菌群，但其在市售样本中占比很低；暂定门RsaHF231未分类属、拟杆菌属、丹毒丝菌科的[Anaerorhabdus]_furcosa_group和g_ZOR0006等在养殖塘小龙虾中含量较低，但在市售小龙虾中占比大幅提升。

在取样过程中发现，市售小龙虾肠道内容物远少于养殖塘小龙虾；运输、销售和禁食使其处于应激状态，进而导致肠道细菌群落发生了改变；肠道菌群组成的改变也会伴随群落功能的变化，COG功能预测结果显示养殖塘小龙虾肠道细菌群落的代谢功能旺盛，市售样本的代谢功能相对较弱，但抗逆能力更强，这与禁食后肠道营养匮乏相适应。

研究微生物群落组成的方法很多，如分离培养法、Biolog-ECO微平板法[26]、变形梯度凝胶电泳法、16S rRNA/18S rRNA/ITS基因克隆文库测序法，以及基于16S rRNA/18S rRNA/ITS基因的高通量测序法等[27]。高通量测序法能一次获得数万条菌株序列信息，比其他方法具有更高的灵敏度、准确度和相对低廉的价格[27]，但其只能揭示样本微生物群落的相对组成情况即各类别的相对丰度，无法展现绝对丰度。本研究Alpha多样性分析显示，市售小龙虾肠道细菌丰度和多样性高于养殖塘小龙虾，这可能与肠道中正常核心类群(变形菌门的柠檬酸杆菌属和哈夫尼菌属)丰度大幅下降造成的其他类群丰度相对增加有关，这种多样性的相对增加并不能给小龙虾带来益处。养殖塘小龙虾肠道内容物比市售小龙虾多出数倍；如果对比细菌的绝对数量，市售小龙虾中变形菌门(正常核心优势菌门)的数量应该比养殖塘低更多，这可能严重影响了小龙虾的正常生理功能，对其造成了不可逆的影响，甚至影响到存活。

本研究揭示了养殖塘小龙虾和市售小龙虾肠道菌群组成的差异，市售小龙虾中柠檬酸杆菌属和哈夫尼菌属等正常肠道核心菌群大幅减少可能与其摄食减少、存活率降低有关，这可为小龙虾养殖投种提供参考和理论解释。同时，在投种中利用微生态制剂改善小龙虾肠道菌群，比如在饲料中拌喂小龙虾肠道中的正常核心菌群(柠檬酸杆菌属或哈夫尼菌属)以恢复虾肠道细菌群落组成，或者使用其他益生菌剂来提高虾的免疫力和存活率，这些都值得进一步研究和探讨。