束仕元， 黄艳娜， 段赛菲， 周茂超， 唐雪明*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海市农业科学院 生物技术研究所，上海 201106)

镰刀菌是一类全球广泛分布的真菌，可导致作物的枯萎病、根腐病等多种病害[1]。致病性的镰刀菌菌株寄主达100多种，许多镰刀菌菌株能在种植或收获后感染多数农作物及观赏植物，如Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici会导致番茄血管枯萎病[2]，Fusariumoxysporumf.sp.cubense会导致香蕉枯萎病[3]，极大地降低了作物的产量和品质，是生产上较难防治的重要病害之一，目前尚无有效的治疗和控制方法，因此，寻找绿色、健康、高效的生物防治手段成为当务之急。常压室温等离子体(ARTP)是近年来提出的一种新的大气压辉光放电冷等离子体源，能在大气压下产生温度在25～40 ℃之间具有高活性粒子浓度(包括处于激发态的氦、氮原子以及羟基自由基等)的等离子体射流，能量在以辐射的方式传递到生物体内后，生物体内各分子便产生电离与激发，产生多种化学性质活泼的自由原子或基团，通过彼此间的相互反应，并与大分子核酸和蛋白质反应，引起分子结构发生改变，影响如DNA合成的中止、酶活性改变等生化过程，使得染色体等各部分结构进一步变化[4]。区别于传统诱变方法，ARTP具有安全稳定、使用方便、突变速度快等多种优点[5]。通过ARTP诱变选育的白色金针菇突变菌株较原始菌株对黑腐病病原菌(P.tolaasii)的拮抗能力提高15.49%[6]。菌株ArthrobacterKQ11在经过ARTP诱变后，其葡聚糖酶活较野生菌株提高50%[7]。本研究利用ARTP技术对解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)TXM-A2进行诱变，以禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)为指示菌，筛选拮抗效果提高的诱变株AR7，以菌株AR7发酵液的OD600值和对尖刀镰孢菌的抑菌直径为指标，采用单因素试验优化其发酵培养基，并最终通过诱变株的发酵过程优化发酵工艺，提高解淀粉芽胞杆菌的生物防治效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 解淀粉芽胞杆菌(B.amyloli-quefaciens)TXM-A2、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)均由本实验室(上海市农业科学研究院生物研究所)提供。

1.1.2 培养基 ①PDA培养基(用于活化禾谷镰孢菌及尖孢镰刀菌)；②LB培养基；③NA培养基(g/L)：蛋白胨 10，葡萄糖 2.5，牛肉浸膏 3；④NB培养基(g/L)：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5；⑤NYBD培养基(g/L)：牛肉浸膏 8，酵母浸粉 5，葡萄糖 10；⑥BPY培养基(g/L)：葡萄糖 5，蛋白胨 10，牛肉膏 5，酵母浸粉 5，NaCl 5；⑦Landy培养基：葡萄糖 20.0 g/L，FeSO40.15 mg/L，L-谷氨酸钠 5.0 g/L，MnSO45.0 mg/L，MgSO40.5 g/L，CuSO40.16 mg/L，KCl 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L；⑧基础发酵培养基(g/L)：葡萄糖 10，蛋白胨 10，KH2PO40.2，MgSO40.2；⑨巴氏梭状芽胞杆菌合成培养基(g/L)：葡萄糖10，MnSO40.01，KH2PO40.5，FeSO40.01，K2HPO40.5，酵母浸粉1，MgSO4·7H2O 0.2，蛋白胨 0.1，NaCl 0.01，CaCO35。

1.1.3 试剂 蛋白胨、酵母浸粉(OXOID)；牛肉浸膏、牛肉膏、葡萄糖、琼脂粉、L-谷氨酸钠(国药集团化学试剂有限公司);CaCl2、NaCl、FeSO4、MnSO4、MgSO4、CuSO4、KCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCO3、K2HPO4(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.1.4 主要仪器与设备 ARTP诱变仪(ⅡS型，无锡源清天木生物科技有限公司)；电热恒温培养箱(DHP-9272，上海华利达)；离位灭菌发酵系统(BIOTECH-5BG，上海保兴生物设备工程有限公司)；细胞培养超净工作台(ACB-61A，新加坡艺思高生物科技有限公司)；生物显微镜(XTL-208C，上海明兹精密仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株TXM-A2的ARTP诱变 ①菌悬液制备：将菌株TXM-A2经试管活化后，按1%(体积分数)的接种量转接于装有100 mL LB培养基的250 mL锥形瓶中，37 ℃、180 r/min摇瓶培养4～5 h至对数生长期。经稀释使菌体活菌数约为107cfu/mL，取1 mL稀释后的菌液4 000 r/min、4 ℃离心处理10 min，将离心后的沉淀物用1 mL无菌生理盐水悬浮，然后进行ARTP诱变处理。②ARTP诱变处理：将上述菌悬液与10%(体积分数)甘油按1∶ 1的比例混合，混合后取10 μL均匀涂在无菌小铁片上，用无菌镊子将铁片置于凹槽内，并在凹槽下放入装有1 mL无菌生理盐水的2 mL规格离心管，设置诱变时间再进行ARTP诱变。处理结束后，将落有铁片的离心管取出置于震荡机低速洗脱1 min后待测。ARTP功率设定120 W，通气量设定10 L/min，利用冷却水循环机，控制温度20 ℃，通过改变诱变时间(2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 s)计算诱变致死率，以未诱变处理的菌体作为对照，根据致死率(%)确定最终的诱变条件。致死率(%)=((对照菌落数-诱变后菌落数)/对照菌落数)×100%。③筛选方法：分别将活菌数约为108cfu/mL的诱变株种子液按1%(体积分数)的接种量转接于装有100 mL Landy培养基的250 mL锥形瓶中，37 ℃、180 r/min摇瓶培养48 h，取发酵液于4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min，经0.22 μm滤膜过滤，再将无菌发酵上清与冷却至55 ℃左右的PDA培养基充分混合，使发酵上清的含量为100.0 μL/mL，然后在平板中央接种培养5～6 d的禾谷镰孢菌菌落边缘菌饼(Φ=7 mm)。以同体积无菌水为对照，每处理重复3次，30 ℃恒温培养4～5 d，观察和测量病原菌禾谷镰孢菌的菌落直径[8]，并计算抑菌率。纯生长量=菌落的平均直径-菌饼直径；抑菌率(%)=((对照菌落纯生长量-处理菌落纯生长量)/对照菌落纯生长量)×100%。④遗传稳定性分析：为了验证诱变株的遗传稳定性，将初筛后获得的菌株分别平板划线连续培养传至5代，并测量每一代的病原菌直径。

1.2.2 种子培养基的筛选 将活菌数约为108cfu/mL的诱变株种子液按1%(体积分数)的接种量分别接种于1.1.2的8种(②～⑨)培养基中，于37 ℃、180 r/min条件下培养48 h，取发酵液4 ℃、12 000 r/min离心20 min后，经0.22 μm滤膜过滤，采用牛津杯法[9]进行尖孢镰刀菌拮抗菌株种子培养基的筛选，测定发酵液的OD600和对尖胞镰刀菌的抑菌直径，每处理3次重复。

1.2.3 发酵培养基的单因素试验 分别以0.5%(质量分数)的磷酸氢二钾、氯化钙、0.012%(质量分数)的硫酸亚铁作为无机盐，分别以2%(质量分数)的硝酸钾、硫酸铵、尿素、黄豆饼粉、酵母浸粉、牛肉膏作为氮源(替换种子培养基的蛋白胨、牛肉膏及酵母浸粉)，分别以0.5%(质量分数)的蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉作为碳源，测定发酵液的OD600以及发酵液对尖胞镰刀菌的抑菌直径，每个处理3次重复，以确定发酵培养基的最佳无机盐、氮源及碳源。

1.2.4 发酵培养基的分配比优化 根据最佳无机盐、氮源及碳源的筛选结果，选用3因素3水平L9正交表进行正交试验，以确定最适宜诱变株生长和产抑菌物质最优的培养基组合。测定方法同1.2.2。

1.2.5 诱变株的发酵过程优化 将诱变株在LB培养基中活化，按1%(体积分数)接种量接种于最适种子培养基中，37 ℃、180 r/min摇瓶培养12 h得到种子液。摇瓶培养后的种子液按4%(体积分数)的接种量接种于装有2.5 L发酵培养基的5 L发酵罐中。发酵参数：通气量1.25 L/min，搅拌转速分别设置为100、200 r/min，培养温度37 ℃，10%(体积分数)的氨水调节pH 7.0。每隔2～4 h取样，血球计数法计算菌株活菌数，DNS法测定发酵液中葡萄糖含量。

2 结果与分析

2.1 致死率曲线的绘制

采用平板计数法绘制解淀粉芽胞杆菌TXM-A2的ARTP诱变致死率曲线，建立ARTP诱变时间与致死率的关系曲线，结果见图1。

图1 ARTP处理TXM-A2的致死率曲线Fig.1 Lethality rate of TXM-A2 induced by ARTP with different treating time

由图1可知，当处理时间在2～10 s之间时，随着处理时间的增加，致死率迅速增加。增加到12 s时致死率急剧下降，12 s后致死率逐渐回升，当诱变时间增加到18 s以上时，致死率接近100%。致死率曲线呈先升高后下降再上升的趋势，这可能与SOS反应(SOS response)有关，细胞DNA在受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，为求生存而产生的一种应急措施。因此选择8 s为最佳诱变时间。

2.2 诱变株的筛选

进行诱变筛选后，从诱变株中分离到1株禾谷镰孢菌拮抗菌株AR7。如表1所示，AR7发酵上清对病原菌的抑制率达72.10%，较出发菌株TXM-A2(图2B)提高约33.15%。

图2 解淀粉芽胞杆菌对禾谷镰孢菌的拮抗作用Fig.2 Antagonistic effect of B. amyloliquefaciens against F. graminearum A：对照； B：TXM-A2； C：诱变株AR7 A: Control； B: TXM-A2； C: Mutagenized strain AR7

表1 菌株TXM-A2和诱变株AR7发酵上清 对禾谷镰孢菌的抑菌率

2.3 遗传稳定性分析

通过对筛选后得到的诱变株AR7进行传代培养并测量每一代禾谷镰刀菌的直径，以验证其遗传稳定性。结果如图3所示，随着诱变株传代次数的增加，病原菌禾谷镰刀菌的生长直径与出发菌株处理下的病原菌基本一致，这表明该诱变株具有良好的遗传稳定性。

图3 诱变株连续培养5代病原菌的直径Fig.3 Diameter of mutagenic strains for 5 consecutive generations of pathogens

2.4 种子培养基的筛选及单因素试验

2.4.1 初始种子培养基的筛选 由图4可知，诱变株AR7在LB和Landy培养基培养时，其发酵菌体密度较高(P<0.05)，OD600值分别为6.230和4.025，其次是BPY和巴氏梭状芽胞杆菌合成培养基(P<0.05)，OD600值分别为3.250、3.040。诱变株AR7经BPY培养基培养后，发酵液对尖孢镰刀菌的抑制作用最强，且相较于NB、基础发酵培养基和巴氏梭状芽胞杆菌合成培养基差异显著(P<0.05)，抑菌直径达到2.833 cm。因此，选择BPY培养基作为诱变株AR7发酵的种子培养基。

图4 不同培养基对诱变株AR7抑菌直径和OD600的影响Fig.4 Effects of different media on the antibacterial diameter and OD600of the mutant AR7

2.4.2 无机盐的筛选 由图5可知，以K2HPO4为无机盐成分，诱变株AR7的OD600最大可达4.630(P>0.05)，抑菌直径为2.479 cm，而相较于磷酸氢二钾和氯化钙，对照组(NaCl)菌株AR7对病原菌的抑菌直径为2.821 cm，差异显著(P<0.05)，因此选择NaCl作为菌株AR7抗菌物质产生的无机盐成分。

图5 不同无机盐对诱变株AR7 抑菌直径和OD600的影响Fig.5 Effects of different inorganic salts on the bacteriostatic diameter and OD600 of mutant AR7

2.4.3 氮源的筛选 由图6可知，诱变株AR7在以黄豆饼粉为氮源时，细胞OD600最大值为8.190(P>0.05)，在以酵母浸粉为氮源时，细胞OD600值为4.553，抑菌直径2.875 cm(P>0.05)，而在含硫酸铵和尿素的培养基中，诱变株AR7不生长(P<0.05)。因此，选择酵母浸粉作为诱变株AR7抗菌物质产生的最佳氮源。

图6 不同氮源对诱变株AR7 抑菌直径和OD600的影响Fig.6 Effects of different nitrogen sources on the bacteriostatic diameter and OD600 of the mutant AR7

2.4.4 碳源的筛选 由图7可知，相较于蔗糖、可溶性淀粉和甘露醇，诱变株AR7在以葡萄糖为碳源的培养基中，细胞OD600值最大可达4.296(P>0.05)，其抑菌直径最大为2.867 cm(P<0.05)。其次为蔗糖，OD600值最大可达4.200，抑菌直径最大为2.717 cm。因此，选择葡萄糖作为诱变株AR7抗菌物质产生的最佳碳源。

图7 不同碳源对诱变株AR7 抑菌直径和OD600的影响Fig.7 Effects of different carbon sources on the bacteriostatic diameter and OD600 of the mutant AR7

2.4.5 培养基的分配比优化 正交试验优化了适宜解淀粉芽胞杆菌诱变株AR7生长的碳、氮源和无机盐离子的浓度配比(表2)。结果表明，6号处理的生物量和抑菌直径均显著高于其他处理及对照组(CK)(P<0.05)，其OD600值为5.543，抑菌直径达3.027 cm。因此，最适宜诱变株AR7生长的碳源、氮源和无机盐浓度配比组合为葡萄糖10 g/L，酵母浸粉25 g/L，NaCl 5 g/L。

2.5 不同搅拌转速对诱变株AR7发酵的影响

按照1.2.4方法对诱变株AR7进行5 L罐发酵，测定不同搅拌转速下该菌的活菌数和糖耗。由图8可知，搅拌转速为100 r/min时，诱变株AR7生长缓慢，0～28 h葡萄糖的比消耗速率仅为0.307 g/(L·h)，发酵50 h达到最大活菌数为0.697×109cfu/mL。将转速提高至200 r/min，诱变株AR7生长速率加快，0～28 h葡萄糖的比消耗速率为0.445 g/(L·h)，发酵24 h最大活菌数为1.65×109cfu/mL，活菌数提高约2倍。

表2 诱变株AR7对尖胞镰刀菌抑制作用最优培养基正交试验结果

图8 不同搅拌转速下AR7的活菌数(A)、 残糖浓度(B)及溶氧值(C)变化曲线图Fig.8 Variation curve of the number of viable bacteria (A), residual sugar concentration (B) and dissolved oxygen value (C) of AR7 under different agitation speeds.

3 讨 论

ARTP介导的细胞诱变会产生更多的随机突变位点，且不易使突变位点产生耐受性，该特性已被应用于工业微生物，如提高纤维素酶[10]、阿维拉霉素[11]、木糖醇[12]等物质的产量。本研究通过ARTP筛选出1株拮抗功能优化菌株，其对禾谷镰孢菌的抑制效果较原菌株提升了33.15%。等离子体法相较于传统的诱变方法[13-14]具有更多的能量和质量的特性，这些特性会对核苷酸水平的细胞分子结构产生更大的破坏，并增加活性化学物质对DNA错配的影响，这些化学物质可能会破坏细胞壁和细胞膜，进而破坏DNA分子[15]，使得诱变初期的致死率持续增加并趋向于100%，呈现先升后降再上升的趋势，这与罗玮等[16]的研究结果一致，推测可能与细胞的损伤修复机制(SOS)有关，SOS作为一个程序化的DNA修复调控网络，LexA(阻遏蛋白)和RecA蛋白在细胞修复过程中起着关键作用[17]，SOS修复机制可以导致DNA恢复和遗传变异，从而促进胁迫条件下细菌的进化，但修复后保真度较低，随着诱变时间的延长，染色体损伤加剧，致死率会再次升高。

本研究筛选得到的初始种子培养基为BPY培养基，通过单因素试验优化种子培养基得到的诱变株AR7最适生长和产生抑菌物质的发酵培养基为葡萄糖10 g/L，酵母浸粉2.5 g/L，NaCl 5 g/L。在发酵培养基的优化过程中，不同于李丽等[18]的研究，诱变株AR7分别在以2%的硫酸铵和尿素为氮源的培养基中均无法生长，而在以2%酵母浸粉为氮源的培养基中抑菌效果最佳，表明诱变株AR7对氮源的种类具有选择性。通过对培养基各组分进行正交试验，发现培养基中各组分的分配比对芽胞杆菌的OD600值和抑菌效果有着显著的影响，这与对于解淀粉芽胞杆菌HAB-7的报道一致[19]。通过5 L发酵罐初步研究了诱变株AR7的发酵工艺，在200 r/min的转速下，诱变株AR7的活菌数可达1.65×109cfu/mL。

通过ARTP技术构建生防型菌株是一种较为新颖的方式，同时为生防型菌剂的开发提供了参考。后续可在5 L罐发酵过程中，进一步优化补料、pH控制剂及消泡等参数对发酵的影响。