姑丽米日·依马木 王巧云 林成

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)H19作为最早发现的印记基因，参与多种肿瘤的发生发展[1-2]，然而，其在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)组织中的表达及其对OSCC生长和转移的影响尚不清楚。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是调控肿瘤细胞Warburg作用的核心分子，与OSCC发生发展密切相关[3-4]。本研究探讨了H19和HIF-1α在人OSCC组织中的表达及其相互关系，并检测了H19对OSCC细胞增殖、侵袭和细胞周期进程的影响以及HIF-1α表达的调控。

1 材料与方法

1.1 组织样本来源

纳入2017 年1月～2018 年1 月解放军474医院口腔科收治的45 例OSCC患者(6 例女性，39 例男性)；34～75 岁，中位年龄54 岁；TNM I-II期：18 例，TNM III-IV期：27 例；病理分化低/中：21 例，病理分化高：24 例。手术切取肿瘤组织及癌旁组织(距离原发灶>5 cm)，所有患者均初次被诊断为OSCC，术前未接受任何抗肿瘤治疗， 研究前签署知情同意书。

1.2 细胞系、细胞培养及慢病毒转染

RPMI-1640+10%FBS(Gibco，美国)培养人OSCC细胞系SCC-4、SCC-9、SCC-25、Cal-27、TCA8113及KB(上海中国科学院)，在293T细胞系中进行慢病毒包装，过表达及干扰病毒(上海汉恒生物)分别感染Cal-27及SCC-9细胞3 d， 1/1000 Polybrene促进感染效率，嘌呤霉素筛选细胞直至稳定生长状态。

1.3 逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

Trizol(Takara，日本)提取OSCC组织及细胞系中总RNA，逆转录得到cDNA产物，设计合成引物：H19、HIF-1α及内参基因GAPDH，10 μL Sybrgreen(ThemoFisher, 美国)中加入0.5 μmol/L引物和5 μL cDNA,置RT-qPCR(7500, ThemoFisher,美国)中进行荧光定量PCR反应，反应条件：95 ℃, 5 min; 95 ℃, 5 s for 40 cycles; 60 ℃, 30 s. 2-ΔΔCt法计算H19及HIF-1α的相对表达水平。

1.4 MTT实验

待检测细胞以1×104个细胞/孔接种到96孔板中，培养过夜，直到细胞在37 ℃、5%CO2条件下贴壁生长。将MTT与RPMI-1640+10%FBS培养基1∶5混合，加入10%FBS，在37 ℃、5%CO2条件下培养4 h，同时避光。用酶标仪检测490 nm处0、24、48、72 h时的吸光度。用24、48、72 h的吸光度与0 h的吸光度之比表示细胞的相对增殖能力。

1.5 细胞侵袭实验

50 mg/L基质胶覆盖Transwell小室，RPMI-1640+1%FBS稀释细胞至5×104个/mL，取200 μL加入上小室，600 μL RPMI-1640+10%FBS加入下室，培养24 h，棉签拭去上室面细胞，多聚甲醛固定10 min后采用0.1%结晶紫染色30 min，40×10显微镜(DM1000，Leica, 德国)观察拍照，ImageJ软件进行细胞计数。

1.6 细胞周期分析

待检细胞消化后重悬， 4 ℃预冷70%乙醇固定过夜100 μg/mL RNase A孵育30 min，250 μL 0.05 g/L碘化丙啶(PI)室温避光处理细胞30 min，流式细胞仪(BD,美国)进行细胞周期分析。

1.7 蛋白质印迹实验(Western blot)

RIPA裂解液裂解细胞蛋白，10% SDS-PAGE电泳分离蛋白质，转移到PVDF膜(0.45 μm，Thermo-Scientific, 美国)，5%脱脂牛奶37 ℃封闭2 h，HIF-1α(1∶500稀释，93 kDa，abcam，ab113642)，β-Actin(1∶2 000稀释， 42 kDa，abcam，ab8226)抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后鼠二抗(1∶2 000稀释，abcam，ab6728)室温孵育2 h，加入ECL化学发光检测试剂，化学发光仪(Geldoc XR， Bio-Rad，美国)检测条带信号强度。

1.8 统计方法

2 结 果

2.1 H19及HIF-1α在组织中的表达及其相关性

RT-qPCR结果显示H19及HIF-1α在OSCC组织中高表达(图 1A、1B)，Pearson相关分析结果显示H19 及HIF-1α表达在OSCC组织中显著正相关(Pearson's rho=0.558,P<0.001，图 1C)。

图 1 H19及HIF-1α在口腔鳞癌及正常组织中的表达及其相关性

2.2 H19在Cal-27细胞中的表达及H19的过表达及干扰细胞系构建

在检测OSCC细胞系H19差异表达的基础上，构建了以Cal-27细胞系为模型的H19过表达细胞系及以SCC-9细胞系为模型的H19干扰细胞系(图 2)。

图 2 H19在OSCC细胞系中的表达及H19的过表达及干扰细胞系构建

2.3 H19过表达及干扰对OSCC细胞增殖的影响

MTT实验结果表明，与Cal-27 oecontrol相比，Cal-27 oeH19细胞活力明显增强(图 3A)，而与SCC-9 sicontrol 相比，SCC-9 siH19细胞活力明显抑制(图 3B)。

图 3 H19过表达及干扰对OSCC细胞增殖的影响

2.4 H19过表达及干扰对OSCC细胞侵袭的影响

Transwell侵袭实验结果表明，与Cal-27 oecontrol(50.6±7.7 个/视野)相比，Cal-27 oeH19侵袭细胞数(124.1±13.5 个/视野)显著增多(图 4A)；而与SCC-9 sicontrol(57.2±8.4 个/视野)相比，SCC-9 siH19侵袭细胞数(107.5±11.3 个/视野)显著减少(图 4B)。

图 4 H19对Cal-27细胞侵袭的影响

2.5 H19过表达及干扰对OSCC细胞周期的影响

细胞周期分析结果表明，H19过表达使G0/G1期比值显著降低，而G2/M期增高，干扰H19使G0/G1期比值显著增高，而S及G2/M期显著降低(图 5)。

图 5 H19对Cal-27细胞周期的影响

2.6 H19过表达及干扰对HIF-1α mRNA及蛋白表达的影响

RT-qPCR结果显示，H19过表达显著上调HIF-1α mRNA及蛋白表达，干扰H19显著抑制HIF-1α mRNA及蛋白表达(图 6)。

图 6 H19对Cal-27细胞中HIF-1α mRNA及蛋白表达的影响

3 讨 论

H19基因位于人类染色体11p15.5， 在胚胎组织中表达较高[5]。近年来许多研究报道 H19参与乳腺癌、胃癌及结直肠癌等多种肿瘤的发生发展：H19可通过调控17β-雌二醇及泛素连接酶E3，促进乳腺癌细胞的增殖及转移[6-8]，并通过靶向CALN1和miR-141促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[9-10]，同时也在结直肠癌及非小细胞肺癌中发挥促癌作用[11-12]，但其在OSCC中的生物学功能仍是空白。

HIF-1α作为糖酵解的主要调节因子，参与肿瘤细胞Warburg效应[13-14]，在OSCC中，研究表明HIF-1α表达与患者不良预后正相关[15]，在体外，其可促进OSCC细胞的迁移、侵袭和放疗抵抗[16-17]，且HIF-1α也参与细胞周期进程的调节[18]。近年有研究指出，H19可促进骨髓间充质干细胞体外缺血缺氧环境下的生存能力[19]，提示H19可能通过调节缺氧相关分子如HIF-1α发挥生物学作用。

本研究发现H19及HIF-1α在OSCC组织中高表达，且呈显著正相关。在体外，H19可促进OSCC细胞增殖、侵袭和细胞周期进程，同时可显著上调HIF-1α mRNA及蛋白表达水平，提示H19促进HIF-1α转录或维持其mRNA稳定性，这为揭示OSCC发生发展的潜在分子机制和治疗提供了新的依据。