□ 张冬生 李 强 翟洪稳 王 娟 河北省食品安全重点实验室 河北省食品检验研究院

牛磺酸是一种含硫氨基酸，主要以游离状态存在于动物乳汁、脑与心脏中，在哺乳动物的心脏中含量最高。牛磺酸除了能促进大脑的正常发育外，还能增强机体的免疫力[1]。

常用的牛磺酸含量测定方法有酸碱滴定法、荧光法、氨基酸分析仪法、薄层扫描法和高效液相色谱法等[2-8]。牛磺酸属于极性大且无紫外吸收的化合物，需进行衍生化。食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定方法为邻苯二甲醛（OPA）柱后衍生高效液相色谱法[9]。样品经预处理，在钠离子氨基酸分析专用柱中被分离，再与OPA进行衍生反应，由荧光检测器进行检测，外标法定量。该方法具有灵敏度高、定量准确等优点，但是分离需使用专用的钠离子氨基酸交换柱和柱后衍生反应器、衍生剂驱动泵等专用辅助仪器。本方法与国家标准测定方法不同，采用柱前在线加入OPA衍生化试剂，在碱性条件下与牛磺酸产生强荧光的物质，通过荧光检测器测定衍生物的含量，以此来确定牛磺酸的含量，其操作简单方便、检测快速、灵敏，且不需辅助仪器，只需通过普通的液相色谱C18柱就可进行牛磺酸的测定。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（配有荧光检测器），安捷伦公司；KQ-250DV超声仪，昆山市超声有限公司；3K15离心机，SIGMA公司。

1.2 试剂与配制溶液

1.2.1 试剂

牛磺酸标准品，纯度≥98%,购于Chem Service；乙腈、甲醇、三水合乙酸钠、氢氧化钾，均为色谱纯，购自上海阿拉丁公司；三乙胺、四氢呋喃、邻苯二甲醛（OPA）、硼酸、2-巯基乙醇（C2H6OS）均为分析纯，购自天津科密欧化学试剂公司；实验用水为GB/T 6682- 2008规定的一级水；聚氧乙烯月桂酸醚（Brij-35），高级纯,购自麦克林公司。

1.2.2 溶液配制

硼酸钾溶液（0.5 mol/L）：称取30.9 g硼酸，26.3 g氢氧化钾，用水溶解并定容至1 000 mL。

邻苯二甲醛衍生溶液：称取0.60 g 邻苯二甲醛，用10 mL甲醇溶解后，加入0.5 mL2-巯基乙醇和0.35 g Brij-35，用0.5 mol/L硼酸钾溶液定容至1 000 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤[10]。现用现配。

1.0 mg/mL的牛磺酸标准储备溶液的配制：准确称取100.0 mg牛磺酸标准品于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。将牛磺酸标准储备液用水稀释制备一系列标准溶液，标准系列浓度为：0.5 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和25.0 μg/mL。

1.3 色谱条件

色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A相为0.01 mol/L NaAc+0.018%三乙胺+0.3%四氢呋喃，B相 为0.01 mol/L的NaAc水溶液+40%乙腈+40%甲醇。流速： 1.0 mL/min；柱温：室温；荧光检测器设置：0～19 min，运行时间：1 min，梯度洗脱。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.4 样品处理

称取5 g奶粉试样（精确至0.01 g），加入40 ℃左右的温水溶解，充分摇匀，加入80 μL冰乙酸，摇匀后移入 100 mL容量瓶中；于超声波振荡器中超声10 min，用水定容至100 mL； 样液离心，取上清液经0.45 μm微孔膜过滤。

1.5 测定

采用自动进样器进行OPA柱前衍生：吸取硼酸缓冲液5.0 μL，然后吸取1.0 μL OPA试剂混合，用水洗针，吸取被测样品0.5 μL，用水洗针，混合6次后依据上述色谱条件进样。

2 结果与分析

2.1 方法优化

2.1.1 衍生试剂的用量

牛磺酸需与衍生试剂反应后利用荧光检测器进行分析，因此衍生试剂的选择及用量非常重要，其直接影响检测结果的准确性。本实验对衍生试剂的用量进行研究，取3份0.5 μL牛磺酸（1 000 μg/L）标样，分别加入 1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL衍生试剂后进行分析。实验结果表明，在样品与衍生试剂比例为1∶2时，测得色谱峰面积达到最大，且重复性良好，随着衍生试剂用量的增加，测得的色谱峰面积没有明显变化，因此选择样品与衍生剂均为1∶2。

2.1.2 衍生化时间的选择

衍生时间也对检测结果产生影响，需考察不同衍生时间对牛磺酸衍生物峰面积的影响。OPA与硫醇试剂连用，在室温碱性条件下与一级氨基酸的衍生化反应仅需30 s即可完成[10]。在其他条件不改变的情况下，本实验对比了3种衍生时间，振荡后直接进样、混合振荡后等待1 min和2 min进样，对比3种反应时间，发现峰面积没有区别，为节约检测时间，选择混合振荡后直接进样。

2.1.3 检测波长的选择

用5 μg/mL牛磺酸 标准溶液 按上述柱前在线衍生化反应，用荧光检测器扫描发射波长和激发波长。发射波长的选择：固定激发波长，在375～550 nm范围内改变发射波长测定荧光强度。激发波长的选择：把发射波长设置为优化好的数值，在260～400 nm范围内改变激发波长测定荧光强度[11]。按照上述方法设置发射和激发波长，根据测定峰值确定牛磺酸的检测波长为EX330 nm，EM530 nm。

2.1.4 标准曲线绘制

以标准溶液的浓度为横坐标轴，吸收峰面积为纵坐标轴，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，结果见表2。

根据表2的数据，由最小二乘法计算牛磺酸标准曲线的线性回归方程y=47.261x+24.42，相关系数r=0.996。色谱峰面积与牛磺酸含量呈良好线性关系，可用于奶粉中牛磺酸含量的定量检测。

表2 牛磺酸标准曲线测定结果

2.2 精密度实验

精确吸取同一试样溶液（25 μg/mL），按上述方法，进行6次平行测定，计算牛磺酸峰面积的RSD=1.67%（n=6），结果如表3。

表3 精密度实验

2.3 重复性实验

取同一批样品6份，准确称量，按本方法处理，进行色谱条件测定，样品中牛磺酸含量为40.93 mg/100 g（n=6），RSD为1.28%（n=6）。结果表明该方法重复性较好，具体数据见表4。

表4 重复性实验

2.4 加标回收率实验

在婴幼儿配方奶粉样品中加入已知含量的牛磺酸标准溶液，按照本方法的试验步骤进行检测，结果见表5。从表中可以看出，加标回收率在96.8%～103.6%，RSD=2.9%（N=6）。

表5 牛磺酸回收率实验结果

2.5 线性范围确定

根据仪器信噪比，配制不同浓度的牛磺酸标准溶液，上机测定，然后根据浓度和峰面积绘制工作曲线。经过多次试验，结果表明当牛磺酸的浓度在0.05～100 μg/mL的范围内时，工作曲线仍然具有良好的线性关系，相关系数均能达到0.996。因此可以确定牛磺酸线性范围为0.05～ 100 μg/mL。

3 结论

本方法使用自动进样器进行程序设定，利用邻苯二甲醛作为柱前衍生剂，完成样品在线柱前衍生，奶粉样品只需要经过水的溶解、冰乙酸沉淀蛋白、过滤处理后即可上机检测，与离线柱前衍生方法相比，减少了烦琐的手工操作和误差，与柱 后衍生方法相比，无需配备专用的柱后衍生仪器，前处理方法简单，操作方便，节约了分析成本，易于推广。该方法还具有较宽的线性范围、较高的回收率和良好的稳定性，能达到婴幼儿配方奶粉中牛磺酸的检测 要求。