吴桂苹 李昌应 谷风林 谭乐和 陶锐 朱红英

摘  要：以黑胡椒为对象，采用蒸汽杀菌、紫外线杀菌和辐照杀菌的方法，研究了不同杀菌方式对黑胡椒中微生物、胡椒碱、胡椒精油及其组成的影响。结果表明，杀菌处理后黑胡椒中的菌落总数、霉菌均有不同程度的减少，辐照杀菌效果最显著。杀菌处理对黑胡椒的胡椒碱、精油含量及其风味物质组成的影响较大，胡椒碱和精油含量均有不同程度的变化，除辐照处理稍微增加了胡椒碱的含量外，其他杀菌处理下胡椒碱和胡椒精油含量均有所降低，蒸汽杀菌后黑胡椒精油和胡椒碱的含量相对最低。未经杀菌处理的黑胡椒精油中单萜烯类化合物总含量相对最低，为61.567%，而倍半萜烯类化合物总含量相对最高，达到36.669%。杀菌处理后黑胡椒中倍半萜烯类化合物均有不同程度的减少，其中辐照杀菌的降低最多，但单萜烯类化合物相对含量变化幅度较大，增加至74.511%。紫外线杀菌相对其他2种杀菌方式对黑胡椒粒中的主要风味物质的组成影响较小，其次是蒸汽杀菌，辐照杀菌方式对黑胡椒粒中主要风味物质的影响相对最大。研究结果可为胡椒杀菌方式的选择提供理论依据。

关键词：杀菌方式;黑胡椒;风味品质

Abstract： The effects of different sterilization methods on microorganisms， piperine， pepper essential oil and the components in black pepper were studied by steam sterilization， ultraviolet sterilization and irradiation sterilization in this study.The results showed that the total number of bacterial colonies and the number of molds in black pepper decreased after sterilization treatment， and irradiation was the most effective in the sterilization treatment. The sterilization methods had a great influence on the content of piperine， essential oil and its flavor composition. The content of piperine and essential oil changed to different degrees， except that the irradiated treatment increased the content of piperine slightly， the content of piperine and essential oil decreased under other sterilization treatment. The content of essential oil and piperine of black pepper was the lowest by steam sterilization than that of the other treatment. In the unsterilized essential oil of black pepper， the total content of sesquiterpene compounds was the highest， up to 36.669%， while the total content of monoterpene was the lowest， 61.567%. After sterilization treatment， the content of sesquiterpene compounds in black pepper decreased to different degrees， among which irradiation sterilization decreased the most， but the relative content of monoterpene compounds increased to 74.511%. Among the three sterilization methods， ultraviolet sterilization had little effect on the main flavor substances in black pepper grains， while irradiation sterilization had the greatest effect. This study could provide a theoretical basis for the selection of pepper sterilization methods.

Keywords： sterilization methods; black pepper; flavor quality

胡椒（Piper nigrum L.）为胡椒科（Piperaceae）胡椒属（Piper）多年生常绿藤本植物，是世界上著名的调味香料[1]。胡椒产品主要分为黑胡椒和白胡椒等初加工产品，但由于黑胡椒、白胡椒等产品干燥方式多摊放在晒场上晒干，易被地面微生物污染，且会受到阴雨天等外界环境和人为因素等的影响而干燥不彻底[2]，在贮藏运输中滋生大量微生物进而影响产品品质和安全性。目前，蒸汽杀菌已广泛应用于乳品、酱类等领域[3-4]，但由于香辛料的风味容易受到影响而应用受限。辐照杀菌是利用电磁射线、加速电子照射杀死微生物的一种物理杀菌方法，相对蒸汽杀菌来说，被杀菌物料的温度在辐照处理过程中变化很小，避免了热敏性成分的损失[5]。目前全球已有40多个国家应用辐照处理200多种食品，其中，最早应用辐照杀菌的是香辛料类产品，我国每年接受辐照处理的香辛料总量在7万t以上[6]，国内外研究报道了辐照技术对发酵调味品[7]、风味豆干[8]、肉类 [9-11]等食品的风味品质的影响，但其对胡椒风味品质的影响尚未见研究报道。紫外线作为一种常用的冷杀菌技术，可以杀灭一些微生物，如细菌繁殖体、病毒等，国内外诸多研究表明紫外线照射对食品杀菌作用效果明显，如鸡肉表面的李斯特菌[12]、大肠杆菌[13]、沙门氏菌[14]以及猪肉表面的微生物[15]经紫外线照射后均明显减少，鲜切黄瓜片的菌落总数明显降低[16]等。目前，在胡椒杀菌方面的研究较少，仅报道了流态化蒸汽杀菌技术[17]、辐照杀菌技术[18-20]等对胡椒中微生物及抗氧化性能的影响。菌落总数是评价食品微生物质量的重要指标，可用来检查食品被细菌污染的程度[21]，亦可用于观察细菌在食品中繁殖的动态，控制生产运输过程的微生物污染[22]。前期研究表明，市售黑胡椒中的菌落总数能达到1.0×106 CFU/g以上，而我国国家标准《黑胡椒》（GB/T 7901—2018）和農业行业标准《胡椒》（NY/T 455—2001）尚无微生物指标限定，虽然国家标准中限定了黑胡椒粒的水分含量≤13.0%，农业行业标准中要求一级黑胡椒的水分含量≤13.0%，二级黑胡椒的水分含量≤13.5%，三级黑胡椒的水分含量≤14%，但在海南相对高温高湿的环境下，水分含量≤13.0%的黑胡椒很容易滋生微生物。目前只有海南省地方标准《胡椒粉》（DB46/T 33—2004）规定了胡椒粉的微生物指标，菌落总数≤30000个/g，大肠菌群≤30个/g，霉菌计数≤100个/g。因此，为提升黑胡椒的品质，本文采用蒸汽杀菌、紫外线杀菌和60Co γ射线辐照杀菌3种杀菌方式对黑胡椒粒进行杀菌处理，分析比较杀菌前后黑胡椒中菌落总数、大肠菌群、霉菌等微生物指标和胡椒碱含量、胡椒精油及其风味化合物组成的变化，为明确不同杀菌方式对黑胡椒风味品质的影响，延长黑胡椒的保质期提供参考和依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试材料  黑胡椒原料购于海南省海口市农贸市场，用编织袋包装，内层有塑料袋密封。

1.1.2  仪器与试剂  AL104电子分析天平，美国Mettler Toledo公司;7890B气相色谱仪，美国安捷伦科技公司;LECO Pegasus HT高通量飞行时间质谱仪，美国LECO公司;KL-RO-20实验室专用超纯水机，中国沃特尔公司;HDM-100电子调温恒温电热套，常州国华电器有限公司;DW-86L728J低温冰箱，青岛海尔股份有限公司;HR50-ⅡA2生物安全柜，青岛海尔特种电器有限公司;G154DW自动蒸汽消毒柜，厦门致微仪器有限公司;QE-300 g高速万能粉碎机，浙江屹立工贸有限公司等。

95%乙醇（分析纯），西陇化工股份有限公司;甲醇（色谱纯），德国默克公司;胡椒碱（色谱纯，纯度>98.00%），北京世纪奥科生物技术有限公司;正己烷（色谱纯），德国默克公司;无水硫酸钠（分析纯），西陇化工有限公司;平板计数琼脂，广东环凯微生物科技有限公司;孟加拉红，广东环凯微生物科技有限公司。

1.2  方法

1.2.1  杀菌方法  （1）蒸汽杀菌：从原包装内取出500 g黑胡椒粒，置于蒸汽仪专用托盘中，待产生蒸汽后放入处理30 min，在生物安全柜内收集该样品于自封袋内，待测，样品标记为1;（2）紫外线杀菌：用生物安全柜内的紫外灯进行紫外线杀菌处理，从原包装内取出500 g黑胡椒粒于密封袋内，铺平后置于在生物安全柜内，开启紫外灯处理30 min，样品标记为2;（3）60Co γ射线辐照杀菌：委托海南浙达辐照科技有限公司对黑胡椒粒进行辐照处理，辐照剂量为8 kGy，样品标记为3。每种杀菌处理方法平行3次;其中，对照样品标记为0。

1.2.2  胡椒碱的测定  依据GB/T 17528—2009《胡椒碱含量的测定 高效液相色谱法》，对杀菌前后的黑胡椒粒中胡椒碱含量进行测定。

1.2.3  精油含量及其组成的测定  依据GB/T 17527—2009 《胡椒精油含量的测定》对杀菌前后的黑胡椒粒中的精油进行提取，提取的精油用正己烷稀释300倍经无水硫酸钠脱除水分后采用气相色谱–飞行时间质谱仪（GC-TOF-MS）对其风味成分进行定性分析，分析条件如下：GC分析条件：采用DB-WAX色谱柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃;升温顺序：起始温度50 ℃，以3 ℃/min上升到75 ℃，保留2 min，以4 ℃/min上升到120 ℃，以1.5 ℃/min上升到140 ℃，保留1 min，最后以20 ℃/min上升到230 ℃，保留3 min;载气为氦气（纯度≥99.999%），流速为1 mL/min，进样量1 μL;TOF-MS分析条件：EI离子源，电离能量，70 eV，离子源温度：200 ℃;传输线温度：250 ℃，质量数扫描范围m/z：35～450，采集速率：10 spec/s，溶剂延迟300 s。

通过NIST14谱库检索数据，采用峰面积归一化法计算各化合物的相对百分比含量。

1.2.4  菌落总数、霉菌和大肠菌群的测定  依据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》、GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》和GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》对杀菌前后的黑胡椒粒进行菌落总数、霉菌和大肠菌群测定。

1.3  数据分析

所有数据采用Excel和SPSS 17.0软件以及GC-TOF-MS仪器自带软件进行分析，总离子流图采用Origin 8.5完成绘图。

2  结果与分析

2.1  杀菌方式对黑胡椒粒中微生物的影响

3种杀菌方式下，黑胡椒粒中的微生物指标如表1所示。由表1可以看出，未杀菌的黑胡椒粒中菌落总数达到8.0×106 CFU/g，经过杀菌后，菌落总数、霉菌数量均有不同程度的减少，其中60Co γ辐照杀菌效果最显著。

2.2  杀菌方式对黑胡椒中胡椒碱含量的影响

由图1可以看出，不同杀菌方式对黑胡椒中胡椒碱含量的影响差异显著（图1）。胡椒碱含量由高到低顺序为辐照杀菌（4.364 g/100 g）>未杀菌（4.237 g/100 g）>紫外线杀菌（4.209 g/100 g）>蒸汽杀菌（3.849 g/100 g），其中辐照杀菌的胡椒碱含量显著高于其他处理的，而未杀菌和紫外线杀菌样品间差异不显著。蒸汽杀菌后的胡椒碱含量相对最低，这可能与蒸汽杀菌的高温条件有关;而经辐照杀菌处理后黑胡椒粒中胡椒碱含量显著高于未杀菌样品，这可能与辐照杀菌对胡椒中胡椒碱的同分异构体造成了一定影响有关。

2.3  殺菌方式对黑胡椒中精油总含量的影响

由图2可见，不同杀菌方式对黑胡椒精油含量的影响差异显著。精油含量由高至低表现为未杀菌（3.992 mL/100 g）>紫外线杀菌（3.764 mL/100 g）>辐照杀菌（3.710 mL/100 g）>蒸汽杀菌（3.275 mL/100 g），其中未杀菌的黑胡椒精油含量显著高于杀菌处理的，而紫外线杀菌和辐照杀菌间差异不显著。蒸汽杀菌后黑胡椒精油含量相对最低，这可能与蒸汽杀菌的高温条件有关，致使黑胡椒粒中的精油总含量损失，而紫外线照射和辐照杀菌均属于冷杀菌技术，不会造成黑胡椒样品温度的升高，因此对黑胡椒的精油含量影响不大。

2.4  杀菌方式对黑胡椒精油组成的影响

不同杀菌方式处理后的胡椒精油的GC-TOF- MS总离子流图如图3所示，经软件自动进行解卷积和谱库匹配，并进行手动删除色谱柱流失化合物后，分析出匹配度大于750的化合物共51種，如表2所示。

从表2可见，不同杀菌方式对黑胡椒精油中物质组成及含量有较大影响。与杀菌处理后的样品相比，未经杀菌处理黑胡椒精油中倍半萜烯类化合物的相对含量最高，达36.669%，而单萜烯类化合物相对含量最低，为61.567%;3种杀菌方式处理后，黑胡椒中倍半萜烯类化合物的相对含量均有不同程度的减少，其中辐照杀菌的降低最多，降至23.329%，但其单萜烯类化合物相对含量变化幅度较大（增加至74.511%），这说明在3种杀菌处理后黑胡椒中的倍半萜烯类化合物可能发生结构变化，致使单萜类化合物含量相对增加，且辐照杀菌处理后变化相对最大。

未杀菌、蒸汽杀菌、紫外线杀菌及辐照杀菌处理后黑胡椒精油中分别鉴定出42、46、50、49种化合物，其中β-石竹烯是相对百分比含量最高的化合物，在不同处理样品中的相对含量分别为32.353%、21.416%、29.323%、18.309%，其次是柠檬烯、3-蒈烯、β-蒎烯、α-水芹烯、α-蒎烯、α-律草烯等萜烯类化合物，这些化合物的相对含量分别达到总含量的98.236%、98.256%、97.800%、97.840%。Jagella等[23]研究报道α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、α-水芹烯、柠檬烯、芳樟醇、甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、丁酸、3-甲基丁酸等化合物是黑胡椒的主要风味物质，Liu等[24]研究报道β-石竹烯、3-蒈烯、D-柠檬烯、β-蒎烯、α-蒎烯等化合物是黑胡椒的主要风味物质。本研究发现，海南市售的黑胡椒中α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、月桂烯、α-水芹烯、柠檬烯和β-石竹烯等7种化合物含量相对较高，这可能与所用黑胡椒原料有关，不同产地、不同品种的黑胡椒主要风味物质可能存在较大差异。不同杀菌方式处理后的黑胡椒风味物质种类差别很小，但主要风味化合物含量存在明显差异，因此，对黑胡椒主要风味物质的相对含量作图，结果如图4所示。从图4可以看出，α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、α-水芹烯、柠檬烯等5种风味化合物相对含量在逐渐增加;3-蒈烯和β-石竹烯2种化合物相对含量变化最大，3-蒈烯相对含量在未杀菌和紫外线杀菌处理样品中相差不大，但在蒸汽杀菌处理中含量增加近1倍，在辐照杀菌处理中含量增加9%左右。β-石竹烯的相对含量在杀菌处理后呈现不同程度的降低，在辐照杀菌处理中含量降低最多，其次是蒸汽杀菌。由此可以初步推断，黑胡椒粒经过杀菌处理后，β-石竹烯在杀菌处理中可能发生结构变化或损失，造成3-蒈烯的相对含量增加。

3  讨论

本研究中，分析对比了蒸汽杀菌、紫外线杀菌和辐照杀菌3种杀菌方式对黑胡椒粒中微生物的影响以及胡椒碱含量、胡椒精油物质组成及含量的影响。经过杀菌处理后，黑胡椒中的菌落总数、霉菌数量均有不同程度的减少，其中60Co γ辐照杀菌效果最显著，这与谢堃等[17]、陈广球[18]、Sádecká[20]的研究报道一致，蒸汽杀菌和60Co γ辐照均能杀灭微生物，且环保、无残留，能较好地保持食品原有的色泽和气味。

目前，国内外对胡椒杀菌方式对胡椒风味品质的研究报道很少，仅Sádecká [20]研究报道电子束辐照剂量对黑胡椒中微生物和挥发性风味物质的影响，谢堃等[17]研究黑胡椒粒经蒸汽杀菌后色泽和气味没有明显变化，但仅对其感官进行评价，Suhaj等[19]研究报道了不同辐照剂量对黑胡椒抗氧化活性的影响。本研究采用气相色谱-飞行时间质谱仪（GC-TOF-MS）和高效液相色谱仪（HPLC）分析测定了黑胡椒精油的组成及胡椒碱的含量，发现杀菌处理对胡椒精油含量和胡椒碱的影响较大，蒸汽杀菌后的黑胡椒精油总含量和胡椒碱含量相对最低，这可能与蒸汽杀菌产生的高温有关，致使热敏性成分含量降低。辐照杀菌的胡椒碱含量显著高于其他处理的，这可能与辐照处理影响了胡椒碱的同分异构体的结构有关，增加了胡椒碱的含量。在香气成分方面，李燕杰等[6]研究比较了电子束辐照剂量（0～15 kGy）对八角、桂皮和花椒3种香辛料中香气成分的影响，发现低剂量的辐照对其烃类、醚类、醇类、醛类等化合物的组成和含量无显著影响，但高剂量的辐照对不同种类化合物的含量略有下降。Sádecká [20]研究报道电子束辐照剂量越大对黑胡椒中挥发性风味物质的影响越大，且辐照对萜烯类化合物的结构有一定影响。这与本研究的辐照杀菌结果一致。本研究发现不同杀菌方式对黑胡椒精油中物质组成及含量有较大影响，不同杀菌方式处理后的黑胡椒风味物质种类差别很小，但主要风味化合物相对含量存在明显差异。未经杀菌处理的黑胡椒精油中倍半萜烯类化合物总含量相对最高，达到36.669%，而单萜烯类化合物总含量相对最低，为61.567%，3种杀菌方式中，黑胡椒中倍半萜烯类化合物均有不同程度的减少，其中辐照杀菌的降低最多，但单萜烯类化合物相对含量变化幅度较大，增加至74.511%。在蒸汽杀菌、紫外线杀菌和辐照杀菌3种杀菌处理方式中，紫外线杀菌对黑胡椒粒中的主要风味物质的组成及其含量影响最小，其次是蒸汽杀菌，辐照杀菌方式对黑胡椒粒中的主要风味物质的影响最大。综合比较3种杀菌方式对黑胡椒中微生物的杀灭效果及其对胡椒碱、胡椒精油及其风味化合物组成的影响，辐照杀菌方式最适于黑胡椒的品质提升。

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责任编辑：崔丽虹